二.第一向等电聚焦原理及操作
等电聚焦程序
11cm胶条
水化 12小时（20℃） 主动水化（50V）或被动水化 S1 S2 S3 S4 S5 250V 线性 30分钟 30分钟 4小时 40,000伏小时 任意时间 除盐 除盐 升压 聚焦 保持 1000V 快速 8000V 线性 8000V 快速 500V 快速
双向电泳培训
主要内容
双向电泳培训实验内容
1.样品制备及试剂准备
2.第一向等电聚焦原理及操作 3.第二向SDS-PAGE实验前准备—试剂配制及制胶 4.第一向等电聚焦后胶条的处理---平衡及转移 5.第二向SDS-PAGE原理及操作
6.染色及成像
双向电泳培训前期准备工作内容
C. 取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室温中放 置10分钟。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。
D．将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+） 对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产 生气泡。
双向电泳上样
水化上样操作
二.第一向等电聚焦原理及操作
双向电泳培训实验内容
二.第一向等电聚焦原理及操作
1. 原理
在第一向分离中蛋白质先按其等电点 （isoelectric point pI值）分开。pI值就是使蛋 白质不带净电荷，且在电场中不发生迁移的特 定pH值。这项将蛋白质按其等电点分离的技 术称为等电聚焦（IEF）。
Isoelectric Focusing
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
双向电泳培训实验内容
二.第一向等电聚焦原理及操作
2. 操作-----双向电泳上样
A. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽 两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不 要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
B. 胶条长度加样体积样品蛋白量7 cm:125 ul(169 ug), 11 cm:185 ul(250 ug), 17 cm:300 ul(405 ug)-----考马氏亮蓝R-250染色
1.培训使用主要仪器
双向电泳培训前期准备工作内容
2.培训使用主要耗材
双向电泳培训实验内容
一.样品制备及试剂准备
1. 从冰箱中取出4℃保存的双向电泳启动试剂 盒。
2. 在上样缓冲液干粉瓶中加入6.1ml去离子水， 使之溶解。 3. 吸取2ml溶解后缓冲液，加入到E.coli蛋白样 品瓶中，制成浓度为1.35mg/ml的蛋白质样品。
原理
等电点（isoelectric point）:在某一pH时，蛋白质的净电荷为零。 蛋白质的等电点取于它的氨基酸组成和构象
The 1st D: Isoelectric Focusing
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
二.第一向等电聚焦原理及操作
等电聚焦程序
7cm胶条
水化 12小时（18℃） 主动水化（50V）或被动水化 S1 S2 S3 S4 S5 250V 500V 线性 快速 30分钟 30分钟 3小时 20,000伏小时 任意时间 除盐 除盐 升压 聚焦 保持
4000V 线性 4000V 快速 500V 快速
二.第一向等电聚焦原理及操作
等电聚焦程序
17cm胶条
水化 12小时（20℃） 主动水化（50V）或被动水化 S1 S2 S3 S4 S5 250V 线性 30分钟 1小时 5小时 60,000伏小时 任意时间 除盐 除盐 升压 聚焦 保持 1000V 快速 10000V 线性 10000V 快速 500V 快速
2. 操作-----双向电泳上样
E. 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶 条长度,本实验1.5ml)，防止胶条水化过程中液 体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条， 使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
F. 对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放 入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。
B. 仪器组装
C. 制胶
配制12%的丙烯酰胺凝胶两块。配12ml凝胶 溶液，每块凝胶6ml，将溶液分别注入玻璃板 夹层中，上部留约1cm的空间，用MilliQ水或 水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合45 分钟。(7cm胶条) 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水 或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。
Carboxylic Groups
Acidic pH R-COO- + H+ => R-COOH Basic pH R-COOH + OH- => R-COO- + H2O
Amino Groups
Acidic pH R-NH2 + H+ => R-NH3+ Basic pH R-NH3+ + OH- => R-NH2 + H2O
C. 制胶
7.5% 30% Acrylamide/Bis 25 ml 12% 40 ml 3.3(X%) = (A)* ml X%
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 25 ml 1.0 ml 25 ml 1.0 ml 25 ml 1.0 ml
10% SDS
双向电泳培训实验内容
3.第二向SDS-PAGE实验前准备—试剂配制及制胶 A. 试剂准备 161-0157 30% Acrylamide/Bis Solution, 29:1, 2×500ml预混合制胶液 161-0700 Ammonium Persulfate, 10 g 161-0801 TEMED, 50 ml 161-0700 Ammonium Persulfate, 10 g 161-0798 Resolving gel buffer, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 1L 161-0416 SDS Solution, 10 % (w/v ), 250 ml