5’
PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH
P-G-G-A-G …
33’‘ … C-G-A-G-P
OH-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
33‘’ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子
或含有该重组分子的无性繁殖系. 作动词时是指基因的分离与重组过程。
基因工程的操作过程
DNA的体外重组（切、接） 重组DNA分子的转化和扩增（转、增） 转化子的筛选和鉴定（检）
基因工程的操作过程
切
接
转
增 检
1 基因工程的基本概念
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵 细菌的限制与修饰作用
hsd R：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限制性甲基化酶 hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 Hind II和Hind III
分子遗传学 1953年 沃森-克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学 1973年 伯格-杰克森-考恩-鲍耶 DNA分子体外拼接
基因工程
2 基因工程的基本条件
A 用于核酸操作的工具酶 B 用于基因克隆的载体 C 用于基因转移的受体菌或细胞
2 基因工程的基本条件
A 用于核酸操作的工具酶
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
II 型限制性核酸内切酶的基本特性
识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 33‘’ … C G A C T T A A G C T C … 5’
基因工程(gene engineering)常和以下名称混用:
遗传工程(genetic engineering); 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重组DNA技术(rebination DNA technique)
OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 33‘’ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
P OH
PstI等产生的3‘粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
33‘’ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
B 基因工程的基本形式
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程 第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程 第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程
C 重组DNA技术的理论基础
19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学 20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学 1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的类型
主要特性
I型
II 型
III 型
限制修饰
多功能
单功能
双功能
蛋白结构 异源三聚体
同源二聚体
异源二聚体
辅助因子 ATP Mg2+ SAM
Mg2+
ATP Mg2+ SAM
识别序列 切割位点
TGAN8TGCT AACN6GTGC 距识别序列1kb处 随机性切割
旋转对称序列
5’
P OH
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 33’‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
PvuII 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH 33’‘ … C-G-A-G-T-C-P
P-C-T-G-G-A-G … OH-G-A-C-C-T-C … 5’
GAGCC
CAGCAG
识别序列内或附近 距识别序列下游
特异性切割
24-26bp处
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的命名
属名
种名 株名
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株
H i n d III H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键
nick OH P 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
Hale Waihona Puke 33’‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
P OH nick
DNA连接酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 33’‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
第十章 基 因 工 程 导 论 1 基因工程的基本概念
A 基本定义 B 基因工程的基本形式 C 基因工程的理论基础
1 基因工程的基本概念
A 基本定义
基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体 在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体） 内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新 性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
EcoRI等产生的5‘粘性末
端
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G …
33‘’ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’ EcoRI 37 ℃ 5‘ … G-C-T-G-OH
P-A-A-T-T-C-G-A-G …
33’‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
因此，供体、受体、载体是基因工程的三大基本元 件。
1 基因工程的基本概念
广义的基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与 应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技 术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组 DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的 大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。