5’-3’延伸
形成的 桥
Paired End Turnround
形成的双 链的桥
Paired End Turnround
等温变性，完成15轮桥式 PCR后，进行线性化，将模 板链切除，保留新合成的子 链
模板链
Paired End Turnround
线性化，3’ -OH阻断 杂交Read2测序引物
HiSeq SBS 测序流程
1
3
Paired End Turnaround
2
Sequencing By Synthesis，SBS测序原理
4种 Fl-NTP’s + 聚合酶
拍照，收集信号
去阻断，切除荧光基团
X 36 - 151
可逆终止化学反应
• 一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子) • 准确度高 • 可以得到同聚物序列
3’ -OH阻 断
Read2测序引 物
新合成的 链
Sequencing By Synthesis 2nd Read
4种 Fl-NTP’s + 聚 合酶
拍照，收集信号
去阻断，切除荧光基团
X 36 - 151
Illumina 测序流程构建(~ 6 hrs)1-8 samples 1-8 samples
CASAVA BaseSpace
Illumina 测序流程构建(~ 6 hrs)1-8 samples 1-8 samples
DNA
cBot HiSeq2500
MiSeq
HiSeq2000 HiSeq2500
GA IIx MiSeq
HCS/RTA ICS MSR
CASAVA BaseSpace
GA IIx MiSeq
HCS/RTA ICS MSR
CASAVA BaseSpace
HiSeq SBS 测序流程
进行Read1 测序 杂交Index 测序引物，进行Index 测序 Paired End Turnround，合成Read1互补链 杂交Read 2 测序引物，进行Read 2 测序
丢弃原始模板链
新合成的链
桥式PCR扩增
单链DNA与FlowCell表面对应接头杂 交，形成“桥” 以接头为引物进行扩增
桥式PCR扩增
变性
变性双链的“桥” 得到与FlowCell相连的两条互补 的单链DNA分子
第二轮桥式PCR扩增
完成桥式PCR扩增
完成28循环的桥式PCR
线性化
双链“桥”变性为单链 红色箭头为P5接头上的 切割位点
模板链杂交： 将单链DNA模板杂交到Flow Cell 上
第一链合成： 以Flow Cell 表面上的oligos为引物， 合成第一链
桥式PCR：
冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR
线性化：
将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除
阻断3’–OH： 防止在后续测序过程化
切割并冲走与P5接头相连的那 条DNA链
阻断
阻断3’ –OH
杂交Read 1 引物将测序引物杂交到的接头上Read1 测序引 物
Illumina 测序流程构建(~ 6 hrs)1-8 samples 1-8 samples
cBot HiSeq2500
MiSeq
HiS 3’加ng Primer
此单链部分与 FlowCell表面上P7接
头相同
此单链部分与 FlowCLangos,P7 和P5接头)
仪器简介
单条DNA 模板
35个循环的桥式PCR
约1000条 DNA模板的 拷贝
cBot
HiSeq Sequencer单链
cBot HiSeq2500
MiSeq
HiSeq2000 HiSeq2500
GA IIx MiSeq
HCS/RTA ICS MSR
CASAVA amples 1-8 samples
DNA
cBot HiSeq2500
MiSeq
HiSeq2000 HiSeq2500
GA IIx MiSeq
HCS/RTA ICS MSR
1-8 samples 1-8 samples
cBot HiSeq2500
MiSeq
HiSeq2000 HiSeq2500
GA IIx MiSeq
HCS/RTA ICS MSR
CASAVA BaseSpace
测序芯片 (Flow Cell)简介
在flow cell上进行cluster簇生成
flow cell是有2个或8个泳道(Lane)的 玻璃片，与一元硬币的厚度相当
杂交测序引物
DNA模板杂交和一链合成
单链DNA分子与FlowCell 表面的对应接头杂交
以杂交的单链DNA为模板， FlowCell上的接头为引物， 合成第一链
含有P7和P5两种接头 的FlowCell表面
接头序列 5’-3’ 延伸
双链DNA变性
模板链被冲洗走 新合成的链留在FlowCell
上
原始模板链
• 合成 • 照相，收集信号 • 去阻断，切除荧
光基团
下一个碱基合成
Clusters
100 Microns
Paired End TurnroundLeabharlann 变性掉已完成测序合成的 片段
恢复被阻断的3’ –OH
Blocked 3’-ends
已完成测序合成的片段
Paired End Turnround
桥式PCR 5’-3’延伸