或
13
内转换 S2
S1 能 量
吸 收
S0
l1
l2
振动弛豫 内转换 振动弛豫
注：
处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态的最低振动能级
过程：振动弛豫→内部能量交换→振动弛豫
15
（3）荧光（fluorescence）
过程：电子由单重态的第一激发态最低振动能级跃迁 到基态的任一振动能级而发射的光量子为荧光

荧光寿命：除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最 大荧光强度的1/e所需要的时间
荧光量子产率（）：
发射的光子数
吸收的光子数
如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为 100%。 物质的荧光量子产率范围一般是多少?
二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
所需能量
大
自旋方向 跃迁几率
不变 接近于1
基态→激发三重态T* 小 改变
10－6（光学禁阻）
8
2、荧光的产生
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2 l3
外转换
l4
T1 T2 发 射 磷 振动弛豫 光
9
激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
第十一章 荧光分析法
药物分析教研室
主要内容
第一节 第二节 第三节
荧光分析法的基本原理 荧光定量分析方法 荧光分光光度计和其他荧光分析技术
2
概述
某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，
发射出比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光
（二级光）。
荧光 luorescence
光致发光
磷光phosphorescence
singlet state
总自旋量子数 S 1 ( 1) 0 22
(S)
多重性 M 1
三重态：两电子自旋方向相同， 自旋量子数分别为 1 和 1 22
triplet state 总自旋量子数 S 1 1 1 22 (T) 多重性 M 3 6
跃迁类型的比较
跃迁类型 基态→激发单重态S*
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2 l3
外转换
l4
T1 T2 振动弛豫
影响体系间跨越几率增大的因素：
含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。 原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运 动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反 转的发生。
在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生几率。
F = K’(I0 – It)
K ’：取决于荧光效率f
荧光光谱 散射光谱
40
能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌啉类、 吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质 等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类 及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等；抗生素类如青 霉素、四环素等；维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗 坏血酸、叶酸及烟酰胺等。此外，中草药中的许多有效成分，不少 是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析 法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好， 取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域 进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
荧光：10-7～10-9s，第一激发单重态的最低振动能级→基态
磷光：10-4～10s； 第一激发三重态的最低振动能级→基态
10
（1）振动弛豫（vibrational relexation）
过程：激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量传 递给溶剂分子，其电子由同一电子能级激发态的较高振 动能级回到最低振动能级的过程。 特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁； 时间约10-12秒。
过程：如果分子在溶液中被激发，激发分子之间、分 子与溶剂之间会发生碰撞而失去能量，这种非辐射跃 迁的过程称为外部能量转换 特点：发生在激发态的最低振动能级和基态之间；所 需时间约为10-7～10-9秒。 结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭
18
内转换
振动弛豫 内转换
S2
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2 l3
瑞利光:光子和物质发生弹性磁撞时，不发生能量交换，仅光子方 向改变，这种散射光称为瑞利光。其波长与入射光相同。
拉曼光:光子和物质发生非弹性磁撞，光子改变方向同时，与物质 有能量交换，散射光波长有所改变，增大或减小，这种散 射光为拉曼光。 波长增大的拉曼光对荧光测定有干扰
39
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b)
λ激发＜ λ荧光＜ λ磷光
10-9~10-7秒
10-4~10秒
25
（二） 激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ lex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ lem
26
激发（光谱二：）（激与吸发收光光谱谱类与似荧）光表示光不谱同激发波长的辐射引起
即磷光波长 > 荧光波长 > 激
发波长
23
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2 l3
外转换
l4
T1 T2 发 射 磷 振动弛豫 光
24
荧光与磷光的比较
跃迁
荧光
激发单重态 最低振动能级→基态
磷光
激发三重态 最低振动能级→基态
光电子能量
E激发＞ E荧光＞E磷光
波长 发射时间
常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子
37
熄灭机理： a碰撞失去能量 b生成不发光的配合物 c溶解氧的存在使荧光物质氧化或氧分子的顺磁性 使激发单重态分子转变为三重态 d浓度较大，自熄灭现象
38
5、散射光的干扰 散射光:当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，
小部分光线由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方 向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
molecular fluorescence （一）分子荧光的产生
1、分子的电子能级与被激发过程 分子的能级包括：电子能级（10ev）、振动能级 (0.1ev)及转动能级(0.001ev)
5
1、分子的电子能级与被激发过程
电子能级的多重性M:M=2S+1；S为总自旋 量子数
单重态： 两电子自旋方向相反， 自旋量子数分别为 1 和 1 22
bb4b3b2 1b0
cc0 1c2c3c4
ν=4
ν=3 ν=2 ν=1 ν=0
ΔΔEΔE4EΔ32E
蒽的能级跃1 迁图
S0
29
二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
荧光寿命(f)和荧光效率 (f)
射跃迁↑ 2、溶剂：
①溶剂介电常数↑，极性↑， π →π * Δ E↓,φ f↑， λ↑
②溶剂粘度σ ↑ ，φf ↑
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3、pH影响
给电子基团
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4、荧光熄灭剂的影响 荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧 光强度降低或熄灭的现象。引起荧光熄灭的物质为荧 光熄灭剂
（3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一 样）成镜像对称关系。
28
镜像关系的原因
由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常荧光
光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
ν=4
ν=3 ν=2
ν=1 ν=0
ΔΔEΔE4ΔE3E2 1
S* 1
蒽的激发光谱和荧光光谱
丹酰肼—可的松的羰基 λex=365nm ,λem=500nm 4）无机离子—具有π电子结构的有机化合物
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三、影响荧光强度的外部因素
relation between fluorescence and molecular structure
1、温度：低温，φ f↑。 原因：温度T↑，分子运动加快， 磁撞几率↑无辐
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（6）磷光（phosporescence）
过程：电子由三重态的第一激发态最低振动能级跃迁 到基态的任一振动能级而发射的光量子为磷光
特点：发生在激发三重态最低振动能级与基态之间。 分子在三重态的最低振动能级上可以存活一段时间， 发射时间约为10-4～10 s。
注：
发射磷光的能量比荧光的能量 小，l2>l1 > l0
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第二节 荧光定量分析方法
一、荧光强度与物质浓度的关系
当一束强度为I0的紫外/可见光照射一浓度为c
、液层厚度为l的液槽时，可在溶液的各个方向观
察到荧光，其