• 但问题是：这些菌株的产量实在太低……
菌株的改良
用紫外线等诱变 利用原生质体诱变 利用双亲灭活原生质体融合 基因工程技术
内生真菌生产紫杉醇的优势
• 生产的可重复性，在工业上可用发酵罐大规模进行 生产，内生真菌生长迅速，易于培养，生产周期短。
• 微生物能在简单的培养基上生长，应用的培养基相 对比较便宜，在收集紫杉酵之前，可以通过改良培 养环境、改进技术来提高产量。
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内生真菌的分离
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内生真菌培养测
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紫杉醇的纯化
内生真菌的分离
• 将植物材料用70％酒精进行表面彻底消毒， 风干后，用无菌刀片切除外部组织，将修整 好的内部组织放在水琼脂培养基上，经过一 段时间的培养后，真菌便生长出来。
• 然后，将分离出的内生真菌菌丝尖端转移到 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，室温培 养至少10d，检查真菌培养平板，不断纯化， 最终获得纯种的内生真菌，同时立即放入含 15％甘油中，-70℃保存，以备发酵使用。
工艺过程
• 细胞悬浮培养：培养基为含1ppm的2，4-D、 0.05ppm的KT及10%椰乳的B-5培养基
• 红豆杉细胞大量培养：培养基与悬浮细胞培养基相 同。在反应器中加入培养液，灭菌后冷却至室温， 接种已经培养30天的悬浮培养细胞，接种量按干细 胞1到2克每升，在25摄氏度下，培养30天，待收获 细胞。
１９９３年，民营企业云南汉德公司成立，其主要业务是从红豆杉中提 取紫 杉醇。１９９５年，汉德公司依靠中科院昆明植物研究所的技术，建成 了中 国最大的年生产能力５０公斤的紫杉醇及其系列产品生产线。１９９９ 年２ 月，该厂的产品还通过了美国ＦＤＡ认证，“顺利扫清了通向美国市场 的障 碍”。
云南省人民政府生物资源开发创新办公室的资料说，汉德公司的紫杉醇 年出 口量为２０—３０公斤（１公斤紫杉醇需用树皮１５—３０吨）。目前 ，中 美合资的汉德生物技术开发有限公司已被云南省列为生物资源开发、出 口创 汇的骨干企业，备受各方重视。２０００年底，该公司与美国签订了价 值６ 亿多元的供货合同。
• 1996年，从西藏红豆杉小枝的内皮层中分离得到的 内生小孢拟盘多毛孢，实验证明它能产生紫杉醇。
• 后来，人们发现从美国南卡罗来纳州柏树的树皮中 获得的小孢拟盘多毛孢、一种土生茜草科植物中分 离得到的内生真菌也能产生紫杉醇
• 我国科研工作者在东北红豆杉、南方红豆杉、云南 红豆杉中均找到产紫杉醇的真菌
在中国，获得紫杉醇产品开发权的还有北京协和制药厂。
从1992年到2001年，将近10年时间，云南红豆杉遭到了毁灭性的破坏，分布 在滇西横断山区中的300多万棵红豆杉，绝大部分被剥了皮（有调查数据认为 是92.5%），现正在慢慢死去。
植物细胞培养
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愈伤组织培养
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愈伤组织的继代培养
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悬浮细胞培养
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细胞大量培养
• 微生物育种和选育速度会明显高于植物细胞株。
• 增加微生物的生产能力比较容易，微生物易于通过 基因工程等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量。
• 药厂利用微生物规模化发酵生产的技术比较成熟， 其培养与发酵条件相对易于控制和掌握，即微生物 发酵法生产紫杉醇的转产风险明显小于细胞培养法 与化学合成法。
利用内生真菌生产红豆杉的过程
工艺过程
• 红豆杉外植体的处理：用自来水充分洗净，再用 70%乙醇冲洗表面后切成小块，在70%乙醇中浸泡2 分钟，再转移至0.1%升汞溶液中浸泡20分钟，然后 用无菌水冲洗4到5次，备用。
• 愈伤组织诱导及培养：将上述无菌红豆杉嫩茎小块 组织接种于含2ppm的2，4-D、0.5ppm的KT及10% 椰乳的MS培养基中，于25摄氏度的二氧化碳培养箱 中培养40天，PH5.8,即可形成小的愈伤组织块，然 后每隔30天进行一次移植继代培养。每次移植继代 培养均取一块愈伤组织，不另其混杂，如此多次移 植继代培养即可获得多个愈伤组织无性系。
• 细胞干燥及收集：每批细胞培养30天后，离心或过 滤收集细胞，用去离子水洗涤两到三次，每次抽干， 然后于30至40摄氏度低温下真空冻干，即得红豆杉 培养细胞成品。
分离纯化
1. 超临界提取 ,然后经己烷脱脂, 氯 仿萃取
2.HPLC 3.梯度洗脱
真菌发酵
发现历史：
• 1993年，美国蒙大拿州立大学的植物病理学家 Strobel和化学家Stierle在短叶红豆杉的韧皮部中发 现了一种内生真菌，它能够自主产生紫杉醇。
• 半合成方法一般以其前体10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ为 原料，延长边链而成。另一种半合成方法是以10-去 乙酰巴卡亭Ⅲ为前体物来合成。
化学合成的缺陷
合成路线复杂，反应条件难以控制，产率低。
用到了剧毒的原料，仅限于实验室水平，很难进行工 业化生产。
半合成中的前体脱乙酰基浆果赤霉素仍是从红豆杉中 提取。
获取紫杉醇的途径
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化学合成
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红豆杉中提取
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植物细胞培养
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真菌发酵
化学合成
紫杉醇分子结构复杂，具有特殊的三环[6+8+6]碳架 和桥头双键以及众多的含氧取代基。先后共有30多 个研究组参与研究其全合成，经20多年的努力，于 1994年才由美国的R．A．Holton与 K．C．Nic~aou两个研究组同时完成紫杉醇的全合 成。随后，S．T．Danishefsky(1996年)、 P．A．Wender(1997年)、T．Mukaiyama(1998年) 和Kuwajima(1998年)4个研究组也完成这一工作。
从红豆杉中提取
• 紫杉醇在植物体内的含量相当低，目前公认含量最 高的短叶红豆杉树皮中也仅含0．069％
• 资源很匮乏
• 红豆杉生长缓慢， 树皮剥去后不能再生， 树木将死亡
红豆杉怀璧获罪
由于美国、加拿大等国家对红豆杉立法保护，药源地转向了中国等 国家。在 中国，８０％的红豆杉集中在云南，而且云南红豆杉的紫杉醇含量 最高。
紫杉醇的生物合成
背景介绍
紫杉醇是目前临床上最畅销的抗恶性肿瘤药物。
其特点是广谱抗癌。现为治疗卵巢癌和乳腺癌的一 线药物，对铂类等已有抗药性的顽固性卵巢癌亦有 效。此外，紫杉醇对肺癌、食管癌、膀胱癌、头颈 部癌、黑色素瘤、结肠癌和HIV引起的卡波济肉瘤 也有效。
人们已在紫杉醇结构基础上进行侧链改造，得到了 多西紫杉。