中药壁虎抗肿瘤作用的实验研究（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：刘菲，王建刚，席守民，马晓娟【摘要】目的探讨中药壁虎抗肿瘤作用及其作用机制。
方法建立移植瘤小鼠S180肉瘤模型,将50只雌鼠随机分为对照组、环磷酰胺组、壁虎高组、中组、低组共5组，分别给于生理盐水灌胃1次/d，CTX（100 mg/kg）腹腔注射1次，壁虎高、中、低组（13.5，9，4.5 g/kg），每天灌胃1次。
14 d后,称取荷瘤小鼠瘤重、胸腺重、脾脏重，计算抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数，观察腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞实验指标；用SABC免疫组化法检测血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的蛋白表达，TUNEL方法检测细胞凋亡率。
结果中药壁虎可抑制小鼠肉瘤S180 生长，高、中、低组抑瘤率可达49.8%，52.8%，43.1%；对免疫器官无影响；可降低肿瘤组织VEGF，bFGF蛋白的表达，诱导肿瘤细胞凋亡。
结论中药壁虎有抗肿瘤活性，其抗肿瘤的部分作用可能通过诱导肿瘤细胞的凋亡及抑制肿瘤血管的生成而实现。
【关键词】中药壁虎小鼠肉瘤S180 血管内皮生长因子碱性成纤维细胞生长因子Abstract：ObjectiveTo study the anti-tumor action of Gecko and its mechanism.MethodsThe transplanted tumor model of the mouse S180 sarcoma was established.Fifty mice were randomly divided into five groups,the control group,the CTX group,the Gecko group(high dose,middle dose,low dose).They were treated respectively with oral administration of saline,and intraperitoneal injection of CTX 100 mg/kg only one time,oral administration of Gecko in doses of 13.5，9，4.5 g/kg,one time a day.After 14 days,the anti-tumor activity was evaluated by tumor tissue weighing. The impact on immune organ was detected by accounting thymus index, spleen index and the number of peritoneal macrophage which phagocytose chicken red blood cells.The protein express of vascular endothelin growth factor(VEGF) and basic fibroblast growth factor(bFGF) were detected by SABC immunohistochemistry. The cell apoptotic rate was detected by TUNEL method.ResultsChinese medicine Gecko could obviously inhibit S180 sarcoma of mice,the inhibiting rate was 49.8%,52.8%,43.1% ,it had no impact on immune organ.It could reduce VEGF and bFGF protein expression in tumor tissue and induce tumor cell apoptosis.ConclusionChinese medicine Gecko has anti-tumor activity and its mechanism might be related toinduction of tumor cell apoptosis and the down-regulation of protein expression of VEGF and bFGF.Key words：Chinese medicine Gecko；S180 sarcoma of mouse；Vascular endothelin growth factor；Basic fibroblast growth factor壁虎又称为守宫、天龙等。
为壁虎科动物无蹼壁虎或多痣壁虎，多疣壁虎及其它几种壁虎的干燥全体，壁虎产于全国各地，性味寒，主要成分含马蜂毒类物质及组织胺类、蛋白质等，有攻毒疗疮、散结止疼、活血化瘀之效。
近年来多作丸、散、膏等剂型入药，临床多用于恶性肿瘤的治疗［1］。
本文旨在用移植性肿瘤整体动物研究方法，观察中药壁虎的抗肿瘤活性及其作用机制。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 药品与试剂中药壁虎购自安徽省亳州市永刚饮片厂有限公司。
将壁虎干燥全体研磨成细粉干燥保存。
用0.2%羧甲基纤维素将壁虎粉稀释成混悬液备用。
环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司(批号H32020857)。
细胞凋亡检测试剂盒（TUNEL法），VEGF、bFGF免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1. 1. 2 动物及瘤株试验所用昆明种小鼠由河南省医学实验动物中心提供（合格证：0001350 ），体重（26±2）g，均为雌鼠。
小鼠S180肉瘤的种鼠由河南省医科所提供。
1. 2 方法1.2.1 中药壁虎对小鼠S180移植瘤的抑制作用观察无菌抽取接种7 d 的小鼠S180腹水，用生理盐水稀释成8 ×106·L-1细胞悬液,每鼠右前腋皮下接种0.2 ml ，24 h 后将小鼠随机分成生理盐水对照组、CTX组、中药壁虎高（13.5 g/kg）、中(9 g/kg)、低(4.5 g/kg)3个剂量组共5 组,每组各10 只，每日小鼠称重后，阴性对照组根据体重按0.2 ml/10 g用生理盐水灌胃1次，环磷酰胺（CTX）按100 mg/kg第1天腹腔注射1次，壁虎组用0.2%羧甲基纤维素稀释至高（0.675 g/ml）、中(0.45 g/ml)、低(0.225 g/ml)浓度混悬液，按0.2 ml/10 g根据体重每天灌胃一次，共14 d。
14 d 后小鼠称重，眼眶取血计数白细胞数，脱臼处死取瘤块称重。
肿瘤抑瘤率= (对照组平均瘤重- 给药组平均瘤重）/ 对照组平均瘤重×100 %［2］1.2.2 中药壁虎对荷瘤小鼠免疫功能的影响按上述方法对小鼠S180移植瘤的抑制作用观察14 d 后，处死动物取胸腺、脾脏称重。
胸腺指数=胸腺重/体重，脾脏指数=脾脏重/体重［3］；观察荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响［4］，对小鼠S180移植瘤的抑制作用观察第14天，用药后2 h每鼠腹腔注射5%鸡红细胞0.4 ml，12 h后处死动物消毒腹部，剪开皮肤，经腹腔注入生理盐水2 ml，转动固定板1 min，然后抽取腹腔液1 ml滴涂于干净载玻片，置于37度的孵箱中温育30 min，以丙酮-甲醇液（1∶1）固定5 min，再用4%姬姆萨瑞特氏液染色5 min，用蒸馏水漂洗晾干。
在油镜下计数200个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数及每个巨噬细胞中被吞噬的红细胞数，按下公式计算：吞噬百分率（%）=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞×100 %吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/200个巨噬细胞1.2.3 小鼠S180肉瘤组织病理学变化肿瘤组织用10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片,常规HE染色,光镜观察肉瘤组织病理变化。
1.2.4 VEGF，bFGF蛋白表达的检测用SABC免疫组化法，操作步骤按照试剂盒说明书进行。
苏木素复染细胞核，将已知的阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照，VEGF及bFGF判定与分析：凡细胞浆、细胞膜出现棕黄色颗粒或均质样棕黄色结构者为VEGF或bFGF免疫反应阳性细胞。
免疫组化染色评分按Rahman等［5］的方法进行，评分标准是：根据着色细胞的比例（染色范围）及染色强度，染色范围（阳性细胞比率）分为0～4级，阴性为0分；阳性细胞1%～25%为1分；25%～50%为2分；51%～75%为3分；76%～100%为4分。
染色强度划分为0～3级，阴性为0分；弱阳性为1分；中等强度为2分；强阳性为3分；两者得分相加为最后得分。
1.2.5 细胞凋亡率检测用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)法检测［6］，小鼠肉瘤石蜡切片常规脱蜡,操作步骤按照试剂盒说明书进行,苏木素复染细胞核，将已知的阳性切片作阳性对照,以不含末端脱氧核糖核酸转移酶的标记液处理的切片作阴性对照，细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞,随机选10个视野,每个视野观察100个细胞,计数阳性细胞数,计算凋亡指数(apoptoticIndex,AI)AI(%)=阳性细胞计数/观察细胞总数×100%。
1.2.6 统计学方法实验数据采用±s表示,应用SPASS12.0统计软件进行统计学处理,多组间数据采用方差分析,两两比较采用t检验。
2 结果2.1 壁虎对小鼠S180肉瘤的抑制作用由表1可知壁虎组各组瘤重明显降低，高、中、低组抑瘤率分别为49.8%，52.8%，43.1% ，与阴性对照组相比有显著差异（P0.01），说明壁虎有抗肿瘤活性。
从白细胞计数结果显示各用药组白细胞数均有所降低，以环磷酰胺组降低明显（P0.05），壁虎各组也降低，但与对照组比较无明显差异(P0.05)。
表1 各组对小鼠S180肉瘤的抑制作用(略)2.2 壁虎对荷瘤小鼠免疫功能的影响见表2。
可知CTX组与对照组相比，胸腺指数与脾脏指数明显降低（P0.05）,壁虎各剂量组与对照组相比无明显差异。
吞噬百分率与吞噬指数方面，CTX组与对照组相比显著降低（P0.01）；壁虎组与对照组相比明显降低（P0.05）。
说明中药壁虎没有增强荷瘤小鼠的免疫功能作用。
表2 各组对荷瘤小鼠免疫功能的影响(略)2.3 小鼠S180肉瘤组织病理学变化见图1。
经HE染色后镜下观察，可见瘤组织呈巢状或片状生长，肿瘤细胞密集排列，细胞大小不同,形态各异；细胞核大小不一，核质比例增大；染色质呈颗粒状，分布不均匀，可见不对称性，多极性核分裂等病理性核分裂象。