PCR法
PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中的阳性克隆。
选择性地扩增发生同源重组的 DNA片段。先在靶载体 中插入neor基因使其突变，然后合成两个引物，它们分别 位于外源靶载体和与靶载体相接处的内源非同源序列上。 将G-418 抗性细胞克隆分别进行PCR。发生同源重组时， 由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增，结果是 DNA片段的拷贝数以指数式增加，得到已知长度DNA双链 片段。与之相反，在随机整合中，由于只有一个引物且为 单方向，所以扩增的片段拷贝数呈线性比例，片段为单链， 长度不定。
正相选择法
在基因敲除载体的目的片段中插入启动子缺失的正向选 择基因neor ，目的基因片段也不包含该基因的启动序列，再 嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染 进靶细胞，可能出现下面几种情况： 打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失； 随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始码，整 合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻； 虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子 能启动neor基因的表达； 外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶 基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。 用G418筛选，则抗性细胞中将只包含③④，根据基因组DNA 酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交可检测出同源重组的 克隆。
筛选方法的特点
PNS及PCR法是对任何靶基因的定点敲除都适用的两 种重要的方法，但它们都有不足之处。 PCR法缺乏直接的选择标记，运用PCR 法进行筛选 时，必须对每个细胞克隆分别进行扩增，因此较为费时费 力，工作量非常大。 PNS法可能是目前应用最广泛的方法，但PNS法要经 过2种药物筛选，有可能对ES细胞产生潜在的影响。 正向选择法适合于敲除那些在细胞中良好表达的基因。
选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 Байду номын сангаас生率极低，动物的重组概率为10-2～10-5，植物的概率 为10-4～10-5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。 表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进 而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变， 达到研究目的基因的目的。 得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中 一条染色体中，所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因 敲除模型，需要进行至少两代遗传。
• 纯合体又称同型合子或同质合子。由两个基因型相同的配 子所结合而成的合子，亦指由此种合子发育而成的生物个 体。纯合体的同源染色体，在其对应的一对或几对基因座 位上，存在着完全相同的等位基因，如AA、aa、AABB、 AAbb、aaBB、AABBcc、aaBBcc等等，具有这些基因型的 生物，就这些成对的基因来说，都是纯合体。在它们的自 交后代中，这几对基因所控制的性状，不会发生分离。
载体构建
1. 2. 3. 获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此ＤＮＡ 片段克隆到一般的质粒载体中； 从重组质粒中切除目的基因的大部分同源ＤＮＡ序列， 只留部分序列在线性质粒载体的两端； 将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中， 使之位于残留目的基因同源顺序的中间；
4.
在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将Ｈ
基因敲除的影响因素
基因打靶的效率是指可检测到的细胞中发生同源重组的 细胞数与转染的细胞总数之比，又称同源重组效率。基因 打靶效率在不同的研究报道中变动范围较大，其波动性来 自较多的影响因素。
(1) 打靶载体的影响
同源片段的来源影响，尽量选择与靶细胞相同品系的基因 片段作为同源片段，可减少碱基错配。当载体同源序列长 度从4kb增加至9kb时，基因打靶效率增加10倍。研究发现， 同源序列达一定长度后，继续的增加对同源重组效率不产 生显著影响。
基因打靶技术的发展简史
• Joshua Lederberg由于在细菌中首先证实同源基因间重组的 原理而获得了1958年的诺贝尔奖。 • Capecchi和Smithies都首先预见到新的遗传物质可以通过同 源重组引入哺乳动物细胞的基因组，并对基因进行特异性 修饰和改造。 • 1980年，Capecchi报道用玻璃针将DNA直接注射入细胞核 可以显著提高基因转移的效率。
同源染色体交叉互换
• 同源重组是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或 者相似DNA序列间的重组。它通常通过一对同源分子非姊 妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。同源重组在进化 过程中高度保守。
• 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）：胚胎干细胞是早期 胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺种分离出来的一类细胞。 具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。 • 嵌合体：遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的 个体。免疫学上则指一个机体身上有两种或两种以上染色 体组成不同的细胞系同时存在，彼此能够耐受，不产生排 斥反应，相互间处在嵌合状态。同一器官出现不同性状的 生物体。
• TK：胸苷激酶蛋白基因，可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC） 转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排 除随机整合的细胞株。
• HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，编码的酶蛋白，可 以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，杀死 肿瘤细胞。这些基因也被称为自杀基因。
同源重组基因敲除
• G418是一种氨基糖苷类抗生素 ，在分子遗传试验中，是 最常用的抗性筛选试剂。当neo基因被整合进真核细胞 DNA后，能启动neo基因编码的序列转录为ｍＲＮＡ ，从 而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞 获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
• neo基因：是对新霉素（neomycin)的抗药基因。细胞表达 该基因可以灭活氨基糖甙类抗生素，破坏卡那霉素和新霉 素（原核生物）以及G418。
完全基因敲除
完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在 细胞或者动物个体中的活性完全消除。 技术路线 基因载体的构建 ES 细胞的获得 同源重组 选择筛选已击中的细胞 表型研究 得到纯合体
打靶载体：基因载体包括载体骨架、靶基因同源序列和 突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序 列是影响同源重组效率的关键因素。通常都包含有两段 与打靶目标位点两端同源的区域，中间一段不同源且为 目的序列，并带有某种药物筛选标记。
2．置换型载体(gene-replacement vector)：断裂位点位于 同源序列区域的外侧或两侧，选择基因位于同源目的序列 内部或外侧。基因重组时以载体的同源序列取代染色体靶 位序列，载体DNA 同源目的序列与染色体靶位点进行两 次同源重组。目前，大多数基因敲除实验都采用置换型载 体进行。
基因打靶的主要筛选策略
基因敲除
韩学凤
概念
• 基因敲除(gene knock-out)又称基因打靶，该技术通过外 源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修 饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段 共同稳定遗传等特点。它是在胚胎干细胞技术和同源重组 技术基础上发展起来的。 • 目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。
• 1981年，Evans等和Marin分别报道从正常的小鼠囊胚中分 离了ES细胞。 • Evans等研究小组在1984年证实通过显微注射引入囊胚的 ES细胞可以分化为成体的各种组织并整合入生殖系。 • 1987年，Evans等和Monk等的研究小组在小鼠胚胎干细胞 中分别对次黄嘌呤磷酸转移酶基因(Hprt)的进行改造，并 获得了经生殖系遗传的突变小鼠。 • 1989年，真正通过同源重组获得的基因敲除小鼠诞生。
名词解释
• 同源染色体是指:一条来自父方，一条来自母方，形状，大小， 结构基本相同，且在减数第一次分裂时能两两配对(联会)的染 色体。 • 联会后的两条同源染色体,是经过染色体复制后的。即每条染 色体含有二条姐妹染色单体。二条染色体就含有四条染色单 体， 故叫四分体。 在配对(联会)的一对同源染色体中,由一个 着丝点相连的二条染色单体叫姐妹染色体单体。由不同着丝 点相连的染色单体，就叫非姐妹染色单体。 因此应该说在减 数第一次分裂时,联会(配对)的同源染色体中。既有姐妹染色 单体,也有非姐妹染色单体。
原理：利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源
片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上 同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使 外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因 插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。
分类：
完全性基因敲除 条件性基因敲除 诱导性基因敲除
新霉素抗性基因Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的 插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因 产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。 ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞， 最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。 常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具 有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除 的理想实验动物。
• 通过基因打靶技术可以对生物体基因组进行基因灭活、点 突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片 段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系 遗传，使遗传修饰生物个体表达突变的性状。通过对遗传 修饰生物体的表型分析和机理研究，帮助人类理解生命现 象的本质、揭示疾病发生的机理、探寻疾病预防和诊疗的 有效方法。
• Capecchi随后证明同源重组可以发生在外源DNA和哺乳动 物细胞染色体的同源序列间。证明这种有缺陷的抗性基因 可以通过与外源DNA间的同源重组得到修复。
• 1985，Smithies实现了人工打靶载体和细胞染色体上β-球蛋 白基因间的同源重组。
• Whitten于1956年成功地使单细胞的受精卵在体外发育到囊 胚阶段。 • Brinster于1965年建立了微滴培养技术,用于着床前小鼠胚胎 的培养。 • Mclaren等对输卵管移植和子宫移植条件进行了优化,并最 终使得通过胚胎移植从体外培养的胚胎产生活的小鼠成为 一种常规的技术。 • Gardner（嘉德纳）建立了将分离的细胞注射入宿主囊胚获 得嵌合体小鼠的方法。