蛋白质与核酸相互作用 DNA分型 DNA核苷酸序列分析 限制酶酶切片段分析 限制酶酶切作图
➢ 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2 - 50kb之间
➢ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1-1000个碱基对
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
1)电泳:将已酶切的待检DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。 2)转膜:将分离的核酸样品转移到滤膜上（印迹转移）。 3)杂交:将滤膜与标记的DNA或RNA探针进行杂交。
印迹法：凝胶印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和 噬菌斑印迹法。 杂交膜：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。
杂交模式图 －
DNA印迹转移
探针杂交
1.3.3 核酸分子杂交
复性（退火）：在一定条件 下变性的两条单链重新结合 为双链的过程
杂交：来源不同的两条单链 结合为双链分子的过程。
核酸探针：指序列或功能特 性已知的标记分子，为双链 或单链，长度通常为几十至 几百bp,包括DNA探针、RNA探 针和cDNA探针。
若退火的核酸来自 不同的生物有机体，则 所形成的双链分子就被 称为杂种核酸分子。
分离DNA片段的大小范围（bp） 50 000~1 000 20 000~1 000 6 000~300 1 000~100 500~25 50~1
凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶 浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高， 孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低， 孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。
➢ 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30bp，常为20nt左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜。避免5个以上 相同碱基的成串排列。 ④引物内部应避免出现出现二级结构，避免两条引 物间互补。 ⑤引物3ˊ末端碱基，应与模板单链严格配对。 ⑥引物中具有或能够加上合适的酶切位点。 ⑦特异性：与数据库中的其它序列无明显同源性。
① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右 一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单 链，以便与引物结合。
② 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热 变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链上的互补序列配对结合。
③ 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚
放射自显影
＋
例题：
某作者用人的一放射性DNA探针与鼠基因组DNA 进行杂交，在所得到的杂交图谱中，第1泳道的点 样处有一略呈拖尾状的放射性杂交斑点；第2泳道 呈较长的弥散形杂交带；第3泳道有3条较清晰的杂 交条带，上下两条带的显色程度相当，中间的条带 显色最深，约分别为其上下两侧条带的两倍。试分 析上述实验结果。
1.3.2 分子杂交类型
根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为3种类型：
Southern杂交由E.M.Southern于1975年创立。
Southern杂交：将DNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上， 然后与核酸探针进行杂交。 Northern杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上， 然后与核酸探针进行杂交。 Western杂交：将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上， 然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质进行反应。
PCR仪
注: Taq来自Thermus aquaticus
1.4.2 PCR反应体系
Tmplate DNA DNA Primers dNTPs Taq DNA Polymerase 10× Buffer
1.4.3 基本反应步骤
1个循环包括高温变性、低温退火和中温延伸反应。 经n次循环后, 一个DNA分子可扩增为2n个分子。
定向克隆应用举例
pPICZα物理图谱
定向克隆应用举例---PCR引物设计
复制机制。
(3)50年代末至60年代，相继提出了“中心法则” 和操纵子学说, 成功地破译了遗传密码，充分 认识了遗传信息的流动和表达途径。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板， 按碱基配对原则，合成一条新的与模板DNA互补的链。
1个PCR循环产生2条双链分子 一般每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能 将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
PCR的基本原理
模板DNA
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
（1）Southern杂交（Southern印迹）：用适当 的限制酶消化待测DNA，电泳后，将凝胶浸于碱 性溶液中以变性DNA，再经毛细作用将变性的 DNA从凝胶中转移至杂交膜上并固定，然后与放 射性同位素标记的核酸探针杂交，再经放射自 显影显示杂交结果。该技术可有效地分析基因 结构或检测待测DNA样本中是否含有特定的序列。
1.2.3 植物转基因的方法 (1)Ti质粒介导 (2)电转化法 (3)基因枪法
1.3 核酸的分子杂交
1.3.1 放射性同位素技术
同位素：原子序数相同而质量不同的元素。
➢ 放射性同位素 同位素可分为稳定同位素和不稳 定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位 素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生α射线、β-射线和γ-射线等，同时从不稳定同位素 变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用 的是放射性同位素。
Localization of RNA
1.4 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）
➢ PCR技术简史 1.4.1 PCR原理 PCR是一种体外无性扩增DNA的实验技 术。待扩增DNA片段经高温变性成为单链后，在低温 （如52℃）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下 以每一条单链为模板，由多聚酶催化延伸引物链，分 别合成一条新链。经过解链、退火和链延伸等多个循 环反应，原DNA片段就可得到大量扩增。
基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具 有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因 置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的 能力。
1962年Arber 发现限
重组DNA实验中常见的主要工具酶
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
末端转移酶
在双链核酸的3ˊ末端加上多聚单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3ˊ末端逐个切除单核苷酸
λ噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5ˊ末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链5ˊ或3ˊ末端的磷酸基团
科学家已几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段， 再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。
1 DNA操作技术
• DNA分子的切割与连接 • 核酸分子杂交 • 凝胶电泳 • 细胞转化 • 核酸序列分析 • 基因的人工合成 • 基因的定点突变 • PCR扩增 • 基因敲除
1.1 核酸的凝胶电泳
原理： 种类：琼脂糖（agarose）凝胶电泳；
聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳 用途：鉴定重组DNA分子
为菌落杂交和空斑杂交。在杂交膜上接种转化子细胞，裂 解以释放待检DNA，变性并固定DNA，与探针杂交，放射自 显影。用于鉴定阳性重组体。
检测重组体克隆的菌落杂交技术
（4）组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）：
指组织或细胞的原位杂交。经适当处理后，使细胞通透 性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，以确定探针互 补序列在胞内的空间位置。
第五章
分子生物学研究方法（上）
本章主要内容
常见的DNA操作技术 基因克隆技术简介 蛋白质组学及研究技术
引言
➢ 重组DNA技术发展史上的重大事件
(1) 40年代，解决了遗传的物质基础问题。确定了
遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋 白质。
(2)50年代，解决了基因的自我复制和世代交替问 题。建立了DNA分子的双螺旋结构模型，提出了半保留
➢ Southern杂交应用举例
环状芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定
（2）斑点杂交（Dot blot）：直接将DNA样品点在滤 膜上使之成为斑点，变性并固定，与探针杂交，放射 自显影。
环状芽孢杆菌C-2基因启动子探针与重组DNA分子的斑点杂交
（3）菌落原位杂交（Hybridization in situ)：又分
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。
➢ 基因工程的主要内容或步骤
“分---切---连---转---筛”
（1）从基因组中分离、或PCR扩增、或人工合成带有目的 基因的DNA片段。 （2）用适当的限制酶分别切割适当的载体分子和含有目 的基因的DNA分子。 （3）将目的基因连接到载体分子上，形成重组DNA分子。 （4）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞中并增殖。 （5）筛选重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克 隆到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。
引物1
引物2
• PCR反应条件
PCR的基本原理 • PCR过程 • PCR的特点 Taq酶 引物1
引物2 Taq酶
• PCR反应条件
PCR的基本原理 • PCR过程 • PCR的特点 第1轮结束
• PCR反应条件
PCR的基本原理 Ta•q PCR过程 • PCR的特点 Taq Taq Taq
• PCR反应条件
(t1/2 = 4.5×109a)
➢ 放射性强度的探测
（1）盖革计数器（Geiger counter tuber）， 闪烁计数器。
（2）放射自显影：X-光乳胶片覆盖于样品，在 黑暗中，-70℃，曝光。