实验3 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质
一、实验目的
学习醋酸纤维薄膜电泳法的原理及操作。

测定人血清中各种蛋白质相对百分含量。

二、基本原理
蛋白质是两性电解质。

在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。

血清中含有数种蛋白质，分别为白蛋白,α1球蛋白,α2球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白,它们所具有的可解离基不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，因此在电场中移动速度不同，故可利用电泳法将它们分离。

醋酸纤维(二乙酸纤维素)薄膜具有匀一的泡沫状结构 (厚约120 µm)，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用，应用范围广和快速简便等优点。

目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。

三、试剂与器材
1．巴比妥—巴比妥钠缓冲液(pH 8.6，0.075 mol／L)：
称取巴比妥钠(A．R)15.4g和巴比妥(A．R．)2.76g，溶于蒸馏水，稀释至1000mL。

用酸度计校测后使用。

2．染色液：
氨基黑10B 0.2g、甲醇(A．R)20mL、冰乙酸(A．R.)4mL，加蒸馏水16mL，混匀即可。

3. 漂洗液：
乙醇(A．R)90mL、冰乙酸(A．R)10 mL，加蒸馏水100mL，混匀即可。

（现配现用）4．透明液：
冰乙酸(A．R)10mL、无水乙醇30mL（1：3），混匀即得。

（现配现用）
5．人血清(新鲜、无溶血现象)。

6．器材：
醋酸纤维薄膜(12×8cm，2×8cm)；厚度120μm；培养皿直径Ф10cm(×8)；点样器(或载玻片)；直尺；铅笔；竹镊子；玻璃棒；烧杯50ml(×2)，200ml (×1)；试管1．5×15cm(×8)；吸管5mL(×1)；水浴锅；电泳槽；直流稳压电泳仪；分光光度计；剪刀。

三、操作步骤
1．搭滤纸桥：
取干净滤纸，折两次使之成为三层滤纸，再折一次，然后附着在电泳槽的支架上，使它一端支架的前沿对齐，而另一端浸入电泳槽的缓冲液中，用缓冲液将滤纸全部湿润驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上。

2．点样：
将醋酸纤维薄膜切成8×2cm条状(或根据需要决定薄膜的大小)，在距一端1.5cm处用铅笔轻轻划一直线，然后浸入缓冲液中，完全浸透后（大约30min），用镊子轻轻取出，将薄膜无光泽的一面向上，平放在于净滤纸上，薄膜上再放一张干净滤纸，吸去多余的
缓冲液。

用玻棒蘸取少量血清，将此血清均匀地涂在载玻片的一端截面上(玻片宽度应小于薄膜) (或用点样器点样)，然后轻轻与距纤维薄膜一端画线处接触，样品即呈一条状涂于纤维膜上。

待血清透入膜内，移去载玻片，将薄膜平贴于已放在电泳槽上，并已浸透缓冲液的滤纸上，点样面向下，点样端为阴极，进行电泳。

3．电泳条件：电压90～110V，电流0.4～0.6mA，通电1.0h。

4．染色：电泳完毕，将薄膜浸于染色液中5min，取出，用漂洗液漂洗至背景无色(约4～5次,每次10min)，再浸于蒸馏水中。

5．制作图谱：待薄膜完全干燥后，浸入透明液中约5min，取出，平贴于干净玻璃片上，干燥，即得背景透明的电泳图谱，可用光吸收计测定各蛋白斑点。

此图谱可长期保存。

6．定量：
将上述漂净的薄膜用滤纸吸干,剪下各种蛋白质色带，分别浸于 4.0mL 0.4mo1／LNa0H溶液中(37℃)5～10min，色泽浸出后，比色(590 nm)。

设各部分的光吸收分别为:A白、Aα1、Aα2、Aβ、Aγ。

则光吸收总和(A总)为：A总=A白+Aα1+Aα2+Aβ+Aγ
白蛋白％＝A白/ A总×100
α1球蛋白%＝Aα1/ A总×L00
α2球蛋白%＝Aα2/ A总×L00
β球蛋白%＝Aβ/ A总×100
γ球蛋白％＝Aγ/ A总×100
四．预习题：
1.为什么说蛋白质是两性电解质？
2．为什么要用PH=8.6的缓冲液？它的作用是什么？
五．思考题：
1.电泳法为什么能把血蛋白分成若干带？
2.为什么将薄膜的点样端放在滤纸桥的负极那端？。