陈羽迪2012332870002 12生物制药（1 ）
大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定实验报告
一、实验目的
1．掌握蒽醌苷元的提取方法—双相酸水解法。

2．掌握梯度PH萃取法提取分离大黄中各种蒽醌苷元的原理及操作方法。

3．掌握羟基蒽醌类化合物的颜色反应及薄层色谱鉴别方法。

二、实验器材
材料及试剂：大黄粗粉、浓硫酸、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、浓盐酸、乙酸乙酯、石油醚、乙醚、普通滤纸、薄层层析硅胶板（2.5 cm×10 cm）、广泛PH试纸、剪刀、铅笔、尺子、点样毛细管、样品管等。

仪器：500mL圆底烧瓶、球形冷凝管（30cm）、橡皮管、烧杯、滴管、层析缸（广口瓶）、250mL分液漏斗、布氏漏斗、抽滤瓶、水浴锅、集热式磁力搅拌器、磁子、循环水式多用真空泵、铁架台等。

三、实验原理
大黄为蓼科植物,味苦,性寒,具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经等功效。

其主要成分为为蒽醌化合物，含量约为3%~5%，大部分与葡萄糖结合苷，游离苷元有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等。

其中，大黄酸具有羧基，酸性最强；大黄素具有β-酚羟基，酸性第二；芦荟大黄素连有羟甲基，酸性第三；大黄素甲醚和和大黄酚的酸性最弱。

根据以上化合物的酸度差异，可用碱性强弱不同的溶液进行梯度萃取分离。

大黄酸R1=H R2=COOH
大黄素R1=CH3R2=OH
芦荟大黄素R1=CH2OH R2=H
大黄素甲醚R1=CH3R2=OCH3
大黄酚R1=CH3R2=H
1.提取原理
双相酸水解法，为一相为与酸水不相互溶的有机溶剂，另一相为酸水，加热回流水解的方法。

由于大黄中的羟基蒽醌类化合物多以苷的形式存在，所以首先要将苷水解成苷元，本实验选用硫酸和乙酸乙酯作为双相酸水解的溶剂，采用加热回流方法，提取大黄药材中的游离蒽醌类化合物。

根据苷元不溶于水，可溶于乙醚、乙酸乙酯等亲脂性有机溶剂的性质，即在加热回流提取过程中，稀硫酸可将蒽醌苷水解成苷元，游离出来的蒽醌苷元随即溶于乙酸乙酯中，从而将蒽醌苷元提取出来。

2. 分离原理
pH梯度萃取法羟基蒽醌类化合物酸性强弱不同，用pH梯度法进行分离。

具有羧基或多个β位酚羟基的蒽醌可溶于5％碳酸氢钠溶液；具有一个β位酚羟基的蒽醌可溶于5％碳酸钠溶液，只具有α位酚羟基的蒽醌，酸性弱，只溶于氢氧化钠溶液。

以分离酸度不同的蒽醌苷元。

也可利用游离蒽醌的极性不同，采用硅胶柱色谱法进行分离。

(1)大黄中游离蒽醌的酸性强弱顺序大黄酸(—COOH)>大黄素(β酚—OH)>芦荟大黄素(醇—OH)>大黄
素甲醚(—OCH3)≈大黄酚(—CH3)。

(2)大黄中游离蒽醌的极性大小顺序大黄酸>大黄素>芦荟大黄素>大黄素甲醚>大黄酚。

大黄酚和大黄素甲醚酸性相近，但极性不同，可用硅胶柱色谱法进行分离。

四、实验流程
大黄素的提取、分离流程图
大黄粗粉50g
2h，稍冷过滤
碱水层乙酸乙酯层
HCl 3
大黄酸沉淀（粗品）
水层乙酸乙酯层
HCl 0.25% NaOH萃取3次
大黄素沉淀（粗品）
大黄酚、大黄素甲醚沉淀（混合物）乙酸乙酯层
五、实验步骤与方法
2．总蒽醌苷元的提取
大黄粗粉50g，置500ml烧瓶中，加20％硫酸溶液100ml和乙酸乙酯250ml，水浴回流提取2个h (加磁子搅拌)，放置，冷后过滤，残渣弃去，乙酸乙酯提取液置分液漏斗中，分出酸水层，乙酸乙酯提取液用蒸馏水洗2次（每次20ml），将乙酸乙酯液放置在锥形瓶中，密封。

3.游离蒽醌的分离与精制
(1)大黄酸的分离和精制
将乙酸乙酯提取液置500m1分液漏斗中，用5％NaHCO3溶液萃取三次（80ml, 60ml, 40ml），合并碱液，在搅拌下滴加浓盐酸，调节ph＝2，放置，待沉淀析出完全后，过滤，并用少量水洗沉淀物至洗出液呈中性，60℃干燥，得深褐色粉末，主为大黄酸。

沉淀干燥后，样品加冰醋酸10ml加热溶解，趁热过滤，滤液放置析晶，过滤，用少量冰醋酸淋洗结晶，得黄色针晶为大黄酸。

(2)大黄素的分离和精制
经NaHCO3溶液提取过的乙酸乙酯液，继用5％Na2CO3溶液萃取三次，每次用量40ml，合并碱液，在搅拌下滴加浓盐酸，调节ph＝2，析出棕黄色沉淀，抽滤，水洗沉淀物至洗出液呈中性，60℃干燥，沉淀经干燥后，用15ml丙酮热溶，趁热过滤，滤液静置，析出橙色针晶，过滤后，用少量丙酮淋洗结晶，得大黄素。

(3) 芦荟大黄素，大黄素甲醚和大黄酚混合物的分离
经Na2CO3提取过的乙酸乙酯液，再用5％NaOH溶液提取三次，每次用量40ml，合并后的碱液同（1）法处理，所得产品为黄色粉末，为芦荟大黄素、大黄酚和大黄素－6－甲醚的混合物。

3.游离蒽醌类化合物的鉴定
(1)化学鉴定
①碱液试验分别取各蒽醌结晶少许置于小试管中，加lml乙醇溶解，加10％氢氧化钠溶液数滴，观察颜色变化。

羟基蒽醌类应呈红色。

②醋酸镁试验分别取各蒽醌结晶少许置于小试管中，各加乙醇lml使溶解，滴加0．5％醋酸镁乙醇溶液，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙色到蓝紫色。

(2)色谱鉴定
①薄层色谱鉴定
吸附剂：硅胶G—CMC—Na板。

样品：上述分别获得的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄酚的三氯甲烷溶液及各相应对照品的三氯甲烷溶液。

展开剂：石油醚—乙酸乙酯—醋酸(2：1：0.2)。

展开方式：上行展开。

显色：在可见光下观察，记录黄色斑点出现的位置，然后用浓氨水熏或喷5％醋酸镁甲醇溶液，斑点显红色。

实验结果记录：观察斑点颜色，记录图谱并计算Rf值。

六、实验现象
大黄粉回流过滤后得黑色残渣和黑色溶液。

除去酸水层，水洗有机层，水洗前pH1~2，四次水洗后的pH分别是pH3~4、 pH5~6、 pH6~7。

水洗后慢慢分层，上层溶液为黑色，下层橙红色并含有少量杂质。

然后用5%的NaHCO3溶液萃取3次。

上层为黑色溶液，中间有灰绿色的乳化层，下层是橙黄色溶液。

加入少许2%NaCl溶液后中间的乳化层慢慢减少。

碱水层加浓HCl时有大量气泡产生,静置溶液中出现少许黄色结晶，再调pH至2~3，得大黄酸。

乙酸乙酯层用5%的Na2CO3溶液萃取3次。

上层为深褐色溶液，含有杂质，中间有乳化层，下层黑色溶液。

得到的碱水层调节pH=2，静置后得黑色溶液并有少量黑絮状沉淀。

抽滤得黑色结晶，为大黄素。

乙酸乙酯层用0.25%的NaOH溶液萃取3次。

上层为灰黑色，中间有乳化层，下层为黑色溶液。

得到的碱水层调节pH=2，静置后得黑色溶液并有少量黑絮状沉淀。

沉淀过滤得黑色沉淀，为芦荟大黄素。

再用5%的NaOH溶液萃取3次。

pH13~14得到酒红色溶液，没有分层现象。

过滤得深褐色沉淀物，进行硅胶柱色谱。

硅胶柱颜色是渐变的，由上到下依次是深褐色、橙色、黄色，收集到亮黄色液体。

进行色谱鉴定。

化学鉴定（用标准液）：
①碱液试验结果：大黄素标准液由亮黄变为粉红，大黄酸标准液、大黄酚标准液、芦荟大黄素标准液都由亮黄变为橙红。

②醋酸镁试验结果：大黄素标准液由亮黄变为粉红，大黄酸标准液、大黄酚标准液、芦荟大黄素标准
液都由亮黄变为橙红。

七、数据记录、结果讨论与分析：
数据：
经测量得原点到展开剂边缘为6.3cm
Rf值的计算：
Rf大黄素=Rf(3.6+4.5+5.3)/3/6.3=0.71（收集了三瓶50ml大黄素溶液，取平均值）
Rf标准大黄素=4.45/6.3=0.72
Rf芦荟大黄素=5.0/6.3=0.79
Rf标准芦荟大黄素=3.7/6.3=0.59
Rf大黄素甲醚=6.2/6.3=1.69
Rf标准大黄素甲醚=5.2/6.3=0.82
Rf大黄酚=5.25/6.3=0.83
Rf标准大黄酚=4.9/6.3=0.78
Rf标准大黄酸=4.0/6.3=0.63
讨论：
1. Rf与Rf标准大黄素甲醚数据偏差较大。

可能是大黄素甲醚的分离不彻底造成的，也有可能是层析中点样的问题。

2. 酸性强弱：大黄酸>大黄素>芦荟大黄素>大黄酚≈大黄素甲醚
3. 注意事项：
（1）游离蒽醌的提取要控制温度，回流不宜太剧烈。

（2）要注意碱液浓度及萃取时的静置时间对实验结果的影响。

（3）萃取时容易发生乳化，而且随着碱液碱度的增高，乳化现象会越严重，所以要轻轻振摇。

（4）每次加碱液进行pH梯度萃取时，注意要测一下乙酸乙酯液的pH。

（5）萃取时一定要注意乳化层的分出，不要混入。

4.羟基蒽醌类遇到碱会变红，因此当pH调节至碱性时，溶液变为酒红色。

也可用此性质来鉴别羟基蒽醌。

5.由于是浓缩液的沉淀，大黄素沉淀和芦荟大黄素沉淀不呈橙黄色，而呈黑色。