• 4、制片： （1）离心：从温箱中取出培养瓶，用毛细吸管将培 养液转入5ml的刻度离心管内。1200rpm，离心 8min。 （2）低渗：弃去上清液。加入37℃预热（中午开 水浴箱）的0.075mol/L KCl低渗液，加至5ml，用 毛细吸管轻轻吹打均匀，放在37℃恒温水浴中 20min。 （3）预固定：在离心管中加入现配的（实验前配制） 甲醇-冰醋酸(3:1)固定液约0.5ml，用毛细吸管吹 打轻轻混匀, 室温固定20min。 （4）再次离心：1200rpm离心8min。
实验步骤
• 1、采血：将皮肤常规消毒后静脉采血约2-3ml 。 • 2、种血及培养：将7号针头缓慢加15滴（约0.3 ml 血样）立即接种含到5ml培养液（含PHA ）的培养 瓶内，轻轻摇匀后将培养瓶放在37℃温箱中培养 72h。培养过程中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。 • 3、秋水仙素处理：在终止培养前4h加秋水仙素处 理（星期五上午11：30加），向各培养瓶中加2滴 秋水仙素（终浓度20µg/ml），轻轻摇匀后继续培 养。
外周血染色 • • • 血样：每班6个同学采集外周血 试剂： 1640培养液含植物血凝素(PHA)， 20µg/ml秋水仙素液， 0.075 mol/L KCl溶液 固定液：甲醇-冰醋酸(3:1) （实验前配制） Giemsa液
实验仪器及用具
• 恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱 、冰箱 • 注射器以及消毒酒精 • 培养瓶120个、吸管120支、离心管 (5ml)120支、 • 冰载玻片： 饭盒加纯净水，加冰，4度冰箱， 120张。
（5）第一次固定：弃上清液，加入固定液约5ml， 立即用吸管吹打使之成细胞悬液，室温固定 20min。1 200rpm离心8min。 （6）第二次固定：同第一次固定。 （7）弃上清液，根据沉淀量的多少，加入适量固定 液1～2滴，用吸管吹打使均匀后制成细胞悬液。 （8）滴片：在30-40cm高处将细胞悬液滴在预冷的 载玻片上，注意动作应迅速，避免载片升温。马 上吹散，酒精灯烘烤（烘干50－60％程度），滴 －吹－烤。 样本编号后学生本次实验结束。老师课后染色。
（9）扣染：用10%吉姆萨染液扣染30min， 染色结束后用清水将浮色冲去，干燥后即 可进行镜检。 （10）照相：在显微镜下寻找分散较好的分 裂相(核型)，再置于显微照相仪下拍摄照片， 并保存。 （11）核型分析：应用核型分析软件，进行 染色体核型分析。
注意事项
1、 秋水仙素处理的时间与浓度要控制得当：秋水仙素处理 时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。 都不宜观察形态及计数。 2、低渗处理的时间与浓度要适当：低渗使红细胞膜破裂， 淋巴细胞膨胀，其处理浓度及时间要 适当。且低渗后混 匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。 3、在滴片时一定要迅速、准确，高度足够高，玻片保持足 够冷。 4、离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之， 细胞易丢失。 5、固定液应在使用前临时配制。 6、载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。