条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不 一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
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解决方法
• 假阳性的原因及解决方法：可能引物设计不合适：选择的扩增序列与 非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物 为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重 新设计引物。还有就是靶序列或扩增产物的交叉污染 。
• 另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限制性内切酶干扰 后续连接反应，降低阳性率。
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回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
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连接
• 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯 键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
• PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非特 异性片段和引物等杂质。
• 切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
• 凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
• PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端残 基的丢失。
• 一般连接25度2小时，16或4度过夜。
• 所以此步对整个分子克隆都至关重要，可适当用酚抽提、柱纯化， 必要的话也可以胶回收。
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酶切目的基因和载体
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酶切注意事项
• 两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再 切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若 盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求 的。只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加 入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。
• 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，可 通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
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酶切常见问题
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纯化酶切产物
• 通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切产物进行连接后获 得的阳性克隆大大低于胶回收酶切产物连接所得阳性克隆。
• 此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化的目的基因与载体 骨架，使之连接不受其他序列干扰。
• 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引 物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非 特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性 扩增。 其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一 来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当 提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
引物设计合理等。
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
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载体构建流程
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PCR常出现的问题
• 1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致， 有时其
• 什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
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PCR产物纯化
• 倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂蛋白、离子等会造成酶 切困难或星活性，残余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克隆失 败。
• 根据不同的目的，可有三类引物选择
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载体构建流程
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PCR得到目的基因
刚开始摸条件时，
都会先做一个梯
度PCR，选出最
适条件。 由于此步为获 取正确的目的基 因，所以尽量避 免PCR的突变格
94
温
度 72
（℃）
55
外重要。其中所
采取的措施有：
22
使用高保真酶、
循环次数控制在
300cycle左右、
（5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl 培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。
（6）将平板置于室温直至液体被吸收。
（7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
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菌落PCR
经典载体构建流程
载体构建流程
1
I 载体构建流程
提取mRNA RT
PCR
cDNA
得到目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
Hale Waihona Puke 酶切目的基因和载体保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒
载体构建流程
导入表达宿主
测试表达情况
2
载体构建流程
3
提取mRNA
• 如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试 剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。.操作 过程中应自始至终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用 具。操作过程所用器材都要经过特殊处理。一次性枪头、离心管 等塑料制品 采用连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
载体构建流程
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载体构建流程
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转化
• 基本步骤：
（1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。
（2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以 混匀内容物。 在冰上放置30分钟。
（3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将 管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。
（4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行 复苏。
载体构建流程
4
RT
• 由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开来 的断裂基因，若以基因组为模板PCR得到的片段克 隆进载体，不能在原核细胞剪接内含子，也不能 在非对象真核细胞中正确剪接表达。所以要克隆 真核蛋白基因，需以不含内含子的连续编码的 mRNA为模板。
• PCR耐热酶不能直接以mRNA为模板扩增，必须通 过逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA,再以cDNA为 模板扩增目的基因。