8.2.2 增强子
• 增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活 性的DNA顺式作用序列，又称强化子。
增强子的特性： • • • • • 双向性。 重复序列。 增强子行使功能与所处的位臵无关。 特异性。 增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与 异源基因相连时也有功能。
8.2.3 终止子
8.1 基因表达的机制
• 8.1.1 外源基因的起始转录
• 外源基因转录起始的速率是基因表达的关键（限速）环节。 • 选择恰当的启动子（例如，可调控的启动子）和相关的调控序列， 是构建一个高效表达系统的首要问题。
诱导型启动子： 如lac、trp、λPR、 λPL、 tac等的启动子
原核生物启动子
组成型启动子： 如T7噬菌体的启动子
亚基 α β β ′ σ
70
基因 rpoA rpoB rpoC rpoD
氨基酸含量 329 1342 1407 613
数量 分子量（kD） 2 1 1 1 37 151 155 70
主要功能 与调节序列结合 形成磷酸二酯键 与 DNA 模板结合 识别一般启动子，并 启动合成
RNA聚合酶：核心酶(α2ββ’)＋σ亚基＝全酶( α2ββ’σ)
真核生物启动子较复杂，可分为：诱导型、组成型和特异 性启动子等类型
8.1.2 mRNA的延伸与稳定
• 外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、 终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。
• 涉及两个问题： 1、要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发 的 mRNA转录的提前终止；
2、要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的 转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内， 从而增加外源基因表达的稳定性。
本章主要内容
• 8.1 基因表达的机制 • 8.2 基因表达的调控元件 • 8.3 外源基因表达系统 8.3.1 大肠杆菌基因表达系统（重点） 8.3.2 芽孢杆菌表达系统（了解） 8.3.3 链霉菌表达系统（了解） 8.3.4 蓝藻表达系统（了解） 8.3.5 酵母表达系统（自学） 8.3.6 哺乳动物细胞基因表达系统（自学） 8.3.7 植物细胞基因表达系统（自学） • 8.4 基因表达产物的检测与分离纯化 • 8.5 基因工程的争论和安全措施
复制水平的调节
• 直接抑制——反义RNA与引物RNA前体互补，使得引物 RNA无法与DNA模板结合，进而抑制DNA复制的频率。 • 间接抑制——反义RNA通过阻断复制激活蛋白因子的合成 而间接抑制DNA的复制。
• 本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特 殊的RNA结构区内实现终止作用。 • 依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅 助因子。
①本征终止子
特征
• 发夹结构(茎环结构)：延缓RNA聚合酶的运动， 不终止RNA的合成，但为转录终止创造条件。 • 寡聚U组成的尾部：转录的终止信号。
两大特征
②依赖型终止子
启动子的特征
8.2.1.1 原核生物的启动子
• 转录起始位点：多数细菌启动子转录起始区的序列 为CAT，转录从第二个碱基起始，该碱基为嘌呤碱 基（A/G）。 • Pribnow框：－10bp处的TATA区（－10序列区）
• Sextama框：－35bp处的TTGACA区（－35区） • 间隔区：内部无明显的保守性，其序列长度比碱基 组成对启动子的功能更重要。
8.2.6 反义子
• 反义RNA（antisence RNA）：同某种天然 mRNA反向互补的RNA分子称为反义RNA，它是 由双链DNA中的无意义链转录产生的，可以用来 阻止被其转化的细胞中存在的与之互补mRNA的 转译活性。（antisence techology）。 • 反义子：编码反义RNA的DNA称为反义子。 • 反义子在DNA的复制、转录和翻译三个水平对基 因的表达起调节作用，其中以对蛋白质合成的抑 制最为普遍。
辅助区
Ⅲ型启动子
• 内启动子：位于转录起始位点的下游，如 tRNA 和 5SRNA 的启动子。
• 外启动子：位于转录起始位点的上游，缺乏相应的 内部序列。例如：脊椎动物U6核小RNA和 7SKRNA启动子，结构类似于真核生物Ⅱ型启动子。
8.2.1.3 启动子与转录启动
大肠杆菌RNA聚合酶的亚基成分
目的基因的表达与调控
基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中 能得到高效表达，即产生人们所需要的高产的目的 • 基因工程技术的核心是基因表达技术。 基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。 • 基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录 成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出 相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境 中经修饰而显示出相应的功能。
聚合酶在体外温浴一段时间，让RNA聚合酶 与特异启动子序列结合。而后选择合适的限 制性内切酶或外切酶消化重组质粒，以未加 RNA聚合酶的DNA作对照。琼脂糖电泳分析酶 切消化产物，被钝化的酶切位点或片段位于 RNA酶保护区域内，即RNA聚合酶的结合位点， 该位点可能含有启动子序列。进一步将该片 段克隆到启动子探针质粒上，分析和检测启 动子的转录活性。
σ factor:
8.2.1.4 启动子的分离
• 随机克隆法 待分离启动子的DNA分子酶切后，连
接到含有 缺启动子的报告基因的载 体上，挑选阳性克隆子后进一步分析 获得的含有启动子的片段。 • 聚合酶保护法 根据RNA聚合法 • PCR 扩增法
• 终止位点上游50～90bp区域，是ρ因子的识别位点。 ρ因 子依赖型终止子也能形成茎环结构，但茎环的GC含量较 低，因此RNA聚合酶在此移动的速度减慢，但停留时间较 短，并且茎环结构的下游没有寡聚U结构，RNA聚合酶只 能在ρ因子的协助下才能有效终止转录。
• ρ因子是一个相对分子量为2.0×105的六聚体蛋白质分子， 它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶。由于它 催化NTP的水解， ρ因子能促使新生的RNA链从三元转录 复合物中解离出来，从而终止转录。
• 从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有 的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列 酶和调控序列的共同作用下完成的。
基因表达在原核生物与真核生物中的差别
• • 目前已构建出多种基因表达系统，包括原核生物表达系统 原核生物基因表达以操纵子的形式进行; 和真核生物表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。 操纵子的调节基因与 RNA聚合酶作用，结构基因开始转录 成mRNA，同时， mRNA立即与核糖体结合转译出相应的 多肽或蛋白质，转录与转译近乎同时完成，mRNA随之被 水解掉。 • 真核生物基因表达系统中，转录在核内进行，生成hnRNA， 核内加工：剪接内含子和外显子，修饰5’和3’末端后形成 成熟mRNA。而后在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋 白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。
8.2.4 衰减子
• 衰减子（attenuator）：是位于mRNA分子前导序列 中的一段控制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即 发生弱化作用的转录终止信号序列，又称弱化子。 • 衰减子最先发现于大肠杆菌色氨酸（trp）操纵子中。
大肠杆菌色氨酸（trp）操纵子中衰减子的作用
• trp前导区的4个片段（1、2、3、4）能以两种不同的方式进 行碱基配对，有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3配对。 • 在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的 翻译对tRNATrp的浓度很敏感。当培养基中trp浓度很低时， 负载有trp的tRNATrp也就少，这样翻译通过两个相邻trp密码 子的速度就很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区 （或停留在两个相邻的trp 密码子处），这时前导区结构是23配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行， 直到trp操纵子中的结构基因全部转录。而当trp浓度高时，核 糖体可顺利通过两个相邻的trp密码子，在4区被转录之前， 核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可自由配对形 成茎－环状终止子结构，终止转录。所以，弱化子对RNA聚 合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位臵。
• 在RNA合成起始以 后，ρ因子即附着在 新生的RNA链上， 靠ATP水解产生的 能量，沿着5’ -3’ 方向朝RNA聚合酶 移动，到达RNA的3’ －OH端后取代了暂 停在终止位点上的 RNA聚合酶，并从 模板和酶上释放 RNA，完成转录过 程。 • 终止过程需要消耗 能量，所以，ρ因子 有终止转录和核苷 三磷酸酶两种功能。
（The sequence of DNA needed for RNA polymerase to bind to the template and accomplish the initiation reaction）
8.2.1.1 真核生物的启动子
Ⅰ型：rRNA 基因启动子 Ⅱ型：mRNA 基因启动子 Ⅲ型：tRNA 基因启动子
8.2.5 绝缘子
绝缘子（insulator）： • 既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件； • 它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动 子起增强或抑制作用； • 绝缘子抑制增强子的功能是有极性的。它只能抑 制处于绝缘子所在边界另一侧的增强子的作用， 而对处于同一结构域的增强子没有抑制作用； • 绝缘子对基因表达的调控是一个非常复杂的过程， 它是通过细胞内特定的蛋白质因子相互作用而产 生调控效应的。
原核生物启动子序列特征 示意图
（The prokaryotic promoter） 5’ -35 -10 16-19 bp
CAT
3’
TTGACA T82T84G78A65C54A45
TATAAT 5-9 bp
start site
T80A95T45A60A50T96 Transcriptional
RNA聚合酶结合和起始转录的序列
8.1.3 外源ห้องสมุดไป่ตู้因mRNA的有效翻译
• 外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：
• AUG(ATG)是首选的起始密码子。 • SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该 序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。 • SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9个碱 基。 • 在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。