获取目的基因呢？
（1）获取目的基因的根据：
如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色体上的位置； 基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。
1.2 基因工程的基本操作程序
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基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 （前提）
2、基因表达载体的构建 （核心） 3、将目的基因导入受体细胞 （关键）
4、目的基因的检测与鉴定 （保证）
一、目的基因的获取
请阅读P9第一和二两段
(一)、目的基因主要是_编__码__蛋__白__质__的__基__因_______ 也可请以是举一出些三具个有以调上控的作用例的子因子
（三）、人工合成目的基因（在DNA合成仪中合成） 基因比较小，核苷酸序列已知
1）反转录法：
目的基因的mRNA
以目的基因转录成的信 使RNA为模板，反转录成 互补的单链DNA，然后在 酶的作用下合成双链DNA， 从而获得所需的基因。
2）人工化学合成法 ：
反转录 单链DNA (cDNA）
合成
双链DNA (即目的基因)
②原理：_D_N_A_复__制____
③条件：_有__一__段_已__知__基__因_的__核__苷__酸_序__列_、 _四_种__脱__氧__核_苷__酸____、__一__对__引__物___ 、
__耐_热__的__D_N_A聚__合. 酶（Taq酶）
④方式：以__指_数__方式扩增，即__2_n _（n为扩增循 环的次数）
别说明理由。
“ 汉 水 丑 生 的生物 同行” 超级群 大型 公 益 活 动 ： 历年高 考题PPT版 制 作。 本 课 件 为 公 益作品 ，版权 所有， 不得 以 任 何 形 式 用于商 业目的 。2012年 1月 15日 ， 汉 水 丑 生标 记。
第一组：①__引__物__I和__引__物__I_I局__部__发__生__碱__基__互__补__配__对__而__失__效__ ②_引__物__I_′__自__身__折__叠__后__会__出__现__局__部__碱__基__互__补__配_ 对而失效
“ 汉 水 丑 生 的生物 同行” 超级群 大型 公 益 活 动 ： 历年高 考题PPT版 制 作。 本 课 件 为 公 益作品 ，版权 所有， 不得 以 任 何 形 式 用于商 业目的 。2012年 1月 15日 ， 汉 水 丑 生标 记。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段 所占比例为 15/16 。 ②在第 三 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等 长的DNA片段。
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是 在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和 高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在 这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋 白是不可能的。
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4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它 的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细 胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌 生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
（二）、利用PCR技术扩增目的基因
（二）、利用PCR技术扩增目的基因
原理：利用DNA双链复制原理 前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。
以便合成引物。
n 过程： 变性、退火、延伸三步曲
➢ 变性：加热至90～
95℃双链DNA解链成
为单链DNA
注➢意退：火双：链冷DN却A至中5，5～G和C比例越高，DNA变性温度越高。
4、目的基因的插入位点不是随机的。
目的基因的插入不能破坏载体上自身需要的基因片段， 以及其上的标记基因，且插入在启动子和终止子之间。
5、受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有 差异。
三、将目的基因导入受体细胞
（一）转化
目的基因进入_受__体__细__胞__内，并且在 受体细胞内维持稳__定___和_表__达__的过程
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身 基因的启动子才能比较有利于导入受体生物中无法转录；
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（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加 一些其他调控元件，如增强子等；
（二）、获取目的合成
一、目的基因的获取（一）从基因中获取目的基因（先建立基因，再从中筛选；）1.基因：概念见P9 2.基因的分类:
种 基因组DNA：含有一种生物的全部基因 类 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌 菌株都可以侵染单子叶植物；
②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目 的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性） 和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移 并插入到染色体DNA上。
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思考与探究：
3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关 细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路， 思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质 的氨基
推测
mRNA 的核苷
推测
结构基因 的核苷酸
酸序列
酸序列
序列
化学 合成
目的 基因
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
使目的基因在受体细胞中稳定存在， 目的： 并且可以遗传给下一代，同时使目的
基因能够表达和发挥作用。
2、表达载体的组成
1. 启动子 2. 终止子 3. 目的基因 4. 标记基因等
碱基互补配对 模板、原料、能量、酶、引物等
解旋方 式
氢键在高温下断 裂，双链全部解
开
解旋酶催化氢键逐步断裂
场所
体外
主要在细胞核中
不同 点
引物 酶
DNA
热稳定DNA聚合酶
（Taq酶）
RNA 解旋酶、DNA聚合酶等
结果
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在短时间内形成 大量的DNA片段
形成完整的DNA分子
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33.(8分)请回答基因工程方面的有关问题：
3.过程: 质粒
DNA分子
同一种限制酶处理
一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得目的基因
DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒）
1、构建重组质粒时，需用
切割
含目的基因的DNA和载体。目的是酶。
2、为防止载体与目的基因自身环化，应该怎么做？ 3、目的基因与载体成功连接的基础是什么？
（二）方法
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
将目的基因导入 动物细胞
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——Ca2+处理法
四、目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
（一）、检测 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入 了目的基因
（1）方法: DNA分子杂交
（2）过程:
①.首先取出转基因生物的基因组DNA ②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素 等作标记,以此做探针 ③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显 示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中
归纳步骤
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
①方法: 分 子 杂 交
②过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,
（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞 的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因 （或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色 荧光蛋白基因等。
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思考与探究2.根据农杆菌可将目的基因导入双子 叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的 原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲 你应该怎样做?
若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交
（二）、鉴定（个体生物学水平） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有
目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作 用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记 基因等。必须构建上述元件的主要理由是：
（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组 引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分 “汉水丑生的生物同行”超级群大型
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⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术
DNA复制
过程
DNA变性（90～95℃）→退火 （复性55~60℃）→子链延伸 （70~75℃）→重复循环
DNA复制起始，RNA引物形成 →DNA片段生成→RNA引物水解 →完整的DNA分子形成
相同 原则 点 条件
60℃部分引物与模 变性
板的单链DNA的特定
延伸
互补部位相配对和
结合
➢ 延伸：加热至70～ 75℃在Taq酶作用下， 合成互补的新DNA链
退火
（二）、利用PCR技术扩增目的基因
二、利用PCR技术扩增目的基因
① 概念：PCR全称为_聚__合_酶__链__式__反_应____，是一项 在生物_体__外_复制_特__定_D_N_A_片__段__的核酸合成技术
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归纳: 基因工程的基本操作程序. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法