传染性胸膜肺炎(APP)核酸检测试剂盒使用说明书
【名 称】
中文名：胸膜肺炎放线杆菌(APP)核酸扩增检测试剂盒 英文名：Actinobacillus pleuropneumonia (APP)Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit 汉语拼音: xiong mo fei yan fang xian gan jun he suan kuo zeng jian ce shi ji he
【适用仪器】主要包括 ABI GeneAmp 9700，或其它取得资格认证的定性 PCR 仪。 【诊断标准】本试剂盒符合中华人民共和国国家标准《牛传染性胸膜肺炎(牛肺疫)诊断技术》GBT 18649-2002 诊断标准。 用户可按照 GB 标准对上述标本进行培养增菌过夜。（经过增菌可提高检出率，推荐使用）。
阴性质控品无带出现(引物带除外)，APP-阳性质控品出现351bp 扩增带，若被检样品出现351bp 扩增带为胸膜肺炎 放线杆菌(APP)阳性，否则为阴性。
【质控标准】 阴性质控品：没有目的条带，全部阴性。 APP-阳性质控品：出现目的条带(351bp)。 以上两个条件应该同时满足，否则，此次试验视为无效。
Cat SA-42152
APP(DNA)
2010(第二版)
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APP-阳性质控品：直接取 3μl 进行 PCR 扩增。 2．PCR 扩增
取单管单份 APP PCR 反应管，加入处理后样品或 APP 阳性质控品和阴性质控品 3μl(枪头勿碰反应管上部不 溶物)，1,0000rpm 瞬时离心 30 秒。将各反应管做好标记，置入 PCR 反应槽内，设置反应体积(30μl)，按照下列条件 扩增：循环条件：94℃→2 分钟，后 93℃ 30 秒→58℃ 30 秒→72℃ 30 秒，共 35 个循环。 3．电泳检测 3.1 2%琼脂糖凝胶配制：稀释50×TAE（或5×TBE）至1×TAE(取20ml50×TAE，加980 ml双蒸水至1L)，称4g琼脂糖放于 500mL 锥形瓶中，1×TAE 200 ml,置入微波炉中加热熔解(避免加热沸腾溶液外溢)，再加入20μl 溴化乙锭(EB)充分混匀。 在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后使用。 3.2 电泳检测：直接取PCR 扩增产物15μl，用加样枪点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm 电压，1×TAE中电泳，紫外灯下 观察结果。 4. 结果判断
【生产企业】
公司名称：北京索奥生物医药科技有限公司 公司地址：北京中关村丰台科技园航丰路 8 号 邮政编码：100070 电话：010-58051371 传真：010-58051378 免费电话：800-990-3566 生产地址：中关村丰台园生命科学孵化中心 公司网址： 电子邮箱：Order@
【注意事项】
使用前请仔细阅读说明书。并且严格按照说明书进行操作。 试剂盒内各种组分使用前应充分融化混匀并经高速短暂离心后试用。每盒试剂请于 3 次内使用完毕。 所有使用的离心管、 Tip 头应用高压灭菌，而且必须不含 DNase 。 PCR 操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR 扩增区等)，防止实验室污染。 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【贮藏、规格及有效期】40 份/盒。-20℃避光保存，避免反复冻融。有效期 12 个月。
【使用方法】
1．DNA 提取 1.1 样品处理 肺脏、淋巴结等固体组织：取 100mg 左右组织标本，加入 1ml 生理盐水，用研磨器充分研磨，取 50μl 左右组织匀浆 转移到 1.5mL 的 EP 管中，加入 50μl 核酸提取液 B(提取液内含不溶物质，使用前室温解冻并充分混匀 )，充分混匀。 100℃处理 10 分钟，13,000rpm 离心 3 分钟，取上清液 3μl 做 PCR 反应。 痰液、培养物、体液等液体标本：充分混匀标本，取 50μl 液体标本，加入加 50μl 核酸提取液 B(提取液内含不溶物质， 使用前室温解冻并充分混匀)，充分混匀。100℃处理 10 分钟，13,000rpm 离心 3 分钟，取上清液 3μl 做 PCR 反应。 阴性质控品：取 50 μl 阴性质控品加入 50μl 核酸提取液 B，充分震荡。后 100℃裂解 10 分钟，然后 13,000rpm 离心 3 分钟，取上清液 3μl 做盒适用于检测发病动物肺脏、淋巴结等组织或痰液以及培养液等标本中胸膜肺炎放线杆菌(APP)DNA，适用于 胸膜肺炎放线杆菌(APP)感染引起的传染性胸膜肺炎辅助诊断及流行病学调查。其检测结果仅供参考。
【原理】
本试剂盒选取一对胸膜肺炎放线杆菌(APP)特异性引物，应用碱裂解法裂解提取 DNA，后者在 Taq 酶作用下，配以 SD-Buffer(内含 Mg2+、Tris-HCl 等)、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过 PCR-体外扩增法对胸膜肺炎放线杆菌 (APP)DNA 进行扩增，产物经凝胶电泳，EB 染色，紫外灯观察，从而达到快速检测之目的。
【组成】
名
称
核酸提取液 B
APP-PCR 反应管
APP 阳性质控品 阴性质控品
数
量
4管 40 管 1管 1管
规
格
500μl/管 50μl/管 50μl/管
500μl/管
【标本采集、保存和运输】
1. 适用标本类型：发病动物肺脏、淋巴结等组织或痰液以及培养液等标本。 2. 标本采集： 2.1 发病动物肺脏、淋巴结等组织标本：无菌条件下取上述组织 1g 左右，置入 1.5ml 洁净 EP 管，立即送检。 2.2 痰液、体液及培养液：取上述标本约 1ml，置入 1.5ml 洁净 EP 管，立即送检。 3．保存和运输：上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃。但不能超过 6 个月，标本运送应采用 0℃冰壶。
Cat SA-42152
APP(DNA)
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