饲用酶活性测定方法附录A木聚糖酶活力的测定方法A1应用范围本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中木聚糖酶的活力。
本标准适用于饲料添加剂木聚糖酶产品，最低检出限为10.0U/g。
A2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
A3木聚糖酶活力单位定义在37℃，pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
A4测定原理木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂发生显色反应。
反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。
A5.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
A5.1乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。
加水溶解，定容至100ml。
A5.2乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。
加水溶解，定容至100ml。
A5.3氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L：称取氢氧化钠20.0g。
加水溶解，定容至100ml。
A5.4乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L，pH为5.50 称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。
再加水溶解，定容至2000mL。
测定溶液的pH。
如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50。
A5.5木糖储备溶液，c(C5H10O5)为10.0mg/ml：称取无水木糖1.000g，加缓冲液（5.4）溶解，定容至100ml。
A5.6木聚糖溶液，浓度为5mg/mL称取木聚糖（Sigma X0672）1.00g，加入氢氧化钠0.32g(或0.5mol/LNaOH溶液16mL)，再加入90mL水（75mL）,加热，磁力搅拌至木聚糖完全溶解。
再加入冰乙酸0.5mL，再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。
如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节pH 至5.50，然后再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。
使用前，适当摇匀。
4℃避光保存，有效期为12h。
A5.7DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。
然后逐步加入100mL 氢氧化钠溶液（5.3），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。
再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。
继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。
用烧结玻璃过滤器过滤。
取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7天后可以使用，有效期为180d。
A6.仪器与设备A6.1实验室用样品粉碎机或碾钵。
A6.2分样筛：孔径为0.25mm（60目）。
A5.3分析天平：感量0.001g。
A6.4 pH计：精确至0.01。
A6.5磁力搅拌器：附加热功能。
A7.4以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。
新配制或超时的DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
A8试样溶液的制备A8.1固体样品的反应用酶液制备按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g。
加入40mL乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。
磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.4）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.4）做适当稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL之间）。
A8.2液体样品的反应用酶液制备液体样品可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）进行稀释、定容（稀释后的酶液中木聚糖的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL之间）。
如果稀释后酶液的pH偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。
A9测定步骤，按下表操作。
反应顺序样品管空白管BK —标准曲线的斜率；C O—标准曲线的截距；M —木糖摩尔质量，M(C5H10O5)=150.2g/moL；t —酶解反应时间，min；1000 —转化因子，1mmol=1000umol。
X D值应在0.04—0.10U/ml之间。
如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
X=X D·D f （2）式（2）中：X —试样木聚糖酶的活力，U/g（或U/mL）；D f—试样的总稀释倍数。
酶活力的计算值保留三位有效数字。
A10. 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过5.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。
A11. 样品酶活力与建议称样量的对应关系见表3表3 样品酶活力与建议称样量的对应关系木聚糖酶活力（U/g或U/mL）称样量（g或mL）≥2000 0.1-0.2500-1999 0.2-0.5200-499 0.5-1.050-199 1.0-2.010-49 2.0-5.0附录Bβ-葡聚糖酶活力的测定B1应用范围本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中葡聚糖酶的活力。
本标准适用于饲料添加剂葡聚糖酶产品。
B2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
B3β-葡聚糖酶活力单位定义在37℃、pH为5.5的条件下，每分钟从4mg/mLβ-葡聚糖溶液中降解释放1ug还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位，以U/g表示。
B4测定原理β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。
反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。
B5试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
B5.1葡萄糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/mL：称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100mL。
B5.2乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。
加水溶解，定容至100mL。
B5.3乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。
加水溶解，定容至100mL。
B5.4氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氢氧化钠20.0g。
加水溶解，定容至100mL。
B5.5乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L,pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。
再加水溶解，定容至2000mL。
测定溶液的pH。
如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节至5.50。
B5.6β-葡聚糖溶液：浓度为4mg/mL 。
称取β-葡聚糖0.80g，加入10mL无水乙醇，润湿β-葡聚糖2分钟，再加入50mL乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）。
磁力搅拌，同时缓慢加热，直至β-葡聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100mL）。
然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）定容至100mL。
β-葡聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。
4℃避光保存，有效期为3天。
（如冷冻保存，有效期为60天，使用前在4℃条件下解冻）B5.7 DNS试剂称取3，5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。
然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（5.4），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。
在逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g，苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。
继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。
用烧结玻璃过滤器过滤。
取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7天后可以使用，有效期为180d。
B6.仪器与设备B6.1实验室用样品粉碎机或碾钵。
B6.2分样筛：孔径为0.25mm（60目）。
B6.3分析天平：感量0.0001g。
B6.4pH计：精确至0.01。
B6.5磁力搅拌器：附加热功能。
B6.6电磁振荡器。
B6.7烧结玻璃过滤器：孔径为0.45μm。
B7.3 分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2mL缓冲液（5.5）和5mLDNS试剂（5.7）。
电磁振荡3s，沸水浴加热5min。
然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。
吸取缓冲液（5.5）4.0mL，加入DNS试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，再用水定容至25mL，以标准空白样为对照调零，在540nm 处测定吸光度A值。
B7.4以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。
新配制或超时的DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
B8.试样溶液的制备B8.1固体样品的反应用酶液制备按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g。
加入40mL乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。
磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.5）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.5）做适当稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL之间）。
B8.2液体样品的反应用酶液制备液体样品可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）进行稀释、定容。
如果稀释后酶液的pH偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.5）做适当稀释定容。