4pi显术简介
4pi也是HELL发明的.而样品的成像通过两个物镜的 亚衍射尺寸的光斑来扫描样品实现的.
缺点 1.需要强光,能量利用率低. 2.过强的光还会引起光致漂白. 3.略贵 4.应用范围较窄 受激损耗的原理也可以应用在其它地方,比如近年来 在纳米光刻领域引起重点关注的双光束刻录技术.
受激发射损耗的基本原理
如果你有一根粗笔，怎么能够用它画细线？ 买块橡皮。先画个粗的，再擦去两边的多余部分. STED用的就是这个原理。 使用一种合适的激光,仅激发一个点的荧光基团使其 发光,然后再用一个面包圈样的光源抑制那个点周围 的荧光强度,这样就只有一个点发光并被观察 了.

受激发射损耗的基本原理
损耗光的波长要选在荧光发射谱的红边,以避免重激 发,激发光与损耗光的时间差要选的合适,既保证有 荧光产生,又能保证一定的损耗几率.
STED荧光显微镜示意图
环形的损耗光是利用一个位相片进行光位相调制， 最终在焦点处形成环形光分布。 按顺序先给激发脉冲(2ps左右)，等荧光物质跃迁上 去了,马上给一个受激辐射波长的脉冲（250ps左 右），用二向色镜区分受激辐射跟自发辐射，探测 过来的自发辐射信号,移动样本就可以三维成像. 起初的主要用于突破STEM显微镜主要用于突破横 向衍射极限 ,横向分辨率可达70nm,而轴向分辨率还 较低, 因为有限的孔径角导致轴向分辨率降低. 近来将和4pi显微术互补性地结合 ,在技术上扩大了 有效孔径角.目前已经获得了100nm的轴向分辨率.
某种染料的光谱.图中蓝色曲线为激发光谱,红色曲线为发射光 谱.620nm~850nm均有可能,670nm最大.这是自发辐射.
STED的发明
STED 受激发射损耗显微术是在 1994 年被施特芬-赫 尔开发出来的,当时赫尔正躺在研究生公寓的床上看 一本有关光学量子理论的书,突然灵光一闪,就发明 了STED. Stefan W. Hell（生于1962年)物理学博士学位，1990 年开始在海德堡大学学习，后留在海德堡欧洲分子 生物学实验室研究.1993年到1996年，他曾作为高级 研究员，在芬兰土尔库大学开发受激发射损耗显微 镜 .1996年，他在哥廷根的马克斯普朗克生物物理 化学研究所，在那里他建立了他目前的研究小组， 致力于高分辨率显微镜的研究。
衍射极限
突破光学衍射极限的办法之一是近场光学显微镜,它 是利用探针探测样品表面的隐失场而获得样品表面 信息. 在一些领域,比如生物上观察活细胞,仅有表面信息 是远远不够的,迄今为止远场光学显微术仍是显示细 胞内部三维结构的重要方法. STED荧光显微镜是一种可以突破光学衍射极限的远 场光学显微术.
激发光可以使基态荧光粒子从基态跃迁到激发态,随 后用损耗光(损耗光就是用来损耗荧光的光)照射样 品,引起荧光物质的受激辐射, 消耗了可以发射荧光 的能级(荧光态)上的粒子数。受激辐射的作用是迫 使粒子在它们被激发之后立刻回到基态 ,使焦斑上 那些受到损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力 , 而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域 内, 于是获得了一个小于衍射极限的发光点. 激发光将基态粒子激发到激发态后,向下跃迁的几率 K=σ×I.
其中σ是分子的吸收截面,I是损耗光的光强. 损耗光的光强越大,损耗的荧光分子越多
通过损耗后 ,外围的荧光被强烈地损耗而留下中心 的荧光 ,但是边缘仍会有残留荧光,可以通过改变入 射光波的波前分布来模糊边缘的荧光.
荧光的产生是自发辐射,处于激发态被损耗光照射后 是受激辐射,受激辐射发出的光子与吸收的光子相同, 选择合适的波长的损耗光就可以使激发态的染料发 出特定波长的光(激光的原理).
荧光物质
有机荧光物质是一类具有特殊光学性能的化合物, 它们能吸收特定频率的光, 并发射出低频率(较长波 长) 的荧光来释放所吸收的能量。某些有机化合物 在紫外和短波长的可见光的激发(这种用来激发的 光叫激发光)下能发出荧光, 产生可见光谱中鲜艳的 颜色, 这类物质称为日光型荧光染、颜料。
荧光物质分子一般都含有发射荧光的基团(称为荧 光团) 以及能使吸收波长改变并伴随荧光增强的助 色团
衍射极限
18 世纪 70 年代,德国物理学家恩斯特-阿贝(Ernst Abbe)发现,可见光由于其波动特性会发生衍射,因而 光束不能无限聚焦.后经瑞利归纳为瑞利判据. 以前人们认为传统光学显微镜的极限为200nm(λ/2). 小于这个尺寸的物体必须借助电子显微镜或隧道扫 描显微镜才能观察。