0. 227
54. 478
自由度
12 1 3 3 3 3 3 16 15
表 3 方差分析表
均方
EAI
ESI
0. 019
4. 765
4. 139 7 456. 323
0. 027
6. 228
0. 042
10. 169
0. 002
0. 871
0. 004
1. 794
＜ 0. 001
0. 098
F值
EAI
定时间，反应结束后把样品的 pH 值调到 4. 0 使蛋白
质沉淀，2 000 r / min 离心 15 min，水洗沉淀蛋白质 2
～ 3 次，回调蛋白质 pH 值至 7. 0 并稀释至合适浓度，
喷雾干燥即为改性后的大豆分离蛋白。
1. 3. 2 乳化活性及乳化稳定性的测定 本实 验 采 用 浊 度 法［11］，略 作 改 进 为： 用 pH 值
研究报告
EAI 0. 309 0. 346 0. 468 0. 583 0. 387 0. 396 0. 515 0. 539 0. 481 0. 473 0. 543 0. 666 0. 479 0. 504 0. 760 0. 689
指标
ESI 18. 6 19. 2 21. 0 23. 0 19. 7 20. 1 21. 3 21. 8 21. 2 20. 9 21. 7 24. 3 21. 1 21. 2 25. 8 24. 5
用蒸馏水把大豆分离蛋白配制成一定浓度的悬 浮液，添加一定量的三聚磷酸钠（ 按 SPI 质量计） ，均
2010 年第 36 卷第 11 期（总第 275 期） 67
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
质处理后，将反应容器置于一定温度的水浴锅中，并
控制体系的 pH 值在 8. 0 左右，不断搅拌使之反应一
进行统计分析。
表 1 L16 （ 45 ） 正交试验因素水平表
水平
1 2 3 4
因素
SPI 浓度/ % STP 添加量/ % 温度/ ℃
7
4
35
9
6
40
11
8
45
13
10
50
时间/ h 2 2. 5 3 3. 5
1. 5 磷酸化 SPI 性质分析 1. 5. 1 蛋白质表面疏水性测定
表面疏水性是采用 ANS（ 1-苯胺基-8-萘磺酸） 作 为荧光探针进行测定［13］。将蛋白质溶于 0. 1 mol / L， pH 值 7. 0 磷酸盐缓冲液中，在室温下间歇搅拌约 30 min，配制成 10 mg / mL 蛋白质分散体系，在高速均质 机上均质（ 10 000 r / min，1 min） ，然后离心（ 3 000 r / min，20 min） ，取上清液并用考马斯亮兰法测定溶液 中蛋白浓度，然后用相同的缓冲液将上清液稀释成不 同的浓度梯度 （ 浓 度 为 0. 01 ～ 0. 2 mg / mL） 。取 10 mL 不同浓度的样品溶液，分别加入 50 μL ANS 溶液 （ 在 0. 1 mol / L，pH 值 7. 0 磷 酸 盐 缓 冲 液 中 含 8 mmol / L） 。使用荧光分光光度计分别在 338 nm （ 激 发波长） 496 nm （ 发射波长） 下测定荧光强度 （ FI） 。 以荧光强度（ FI） 对蛋白质浓度作图，计算曲线的初 始斜率为疏水性指数。 1. 5. 2 红外光谱分析
利用 SPSS 提供的一般线性模型中的 Multivariate 过程，对实验数据进行方差分析和多重比较，分别见 表 3 和表 4。
从表 3 方差分析的结构可以看出，乳化活性和乳 化稳定性校正模型的 P 值均 ＜ 0. 05，说明本次的试 验设 计 是 有 意 义 的 。对 于 乳 化 活 性 这 一 考 察 指 标 来
BüChi Spray Dryer B-290 型 喷 雾 干 燥 仪 （ 瑞 士 BüChi Spray Dryer 公司） ，KND-HYP8 型消化炉（ 上海 纤检仪器有限公司） ，KDN-2008 全自动定氮仪（ 上海 纤检仪器有限公司） ，722 型分光光度计（ 天津市普瑞 斯仪器有限公司） ，JJ-2B 高速组织捣碎机（ 金坛市荣 华仪器制造有限公司） ，FS-1 可调高速匀浆机（ 金坛 市荣华仪器制造有限公司） ，LD4-2A 型离心机（ 北京 医用离心机厂） ，FE20 型 pH 计（ 梅特勒-托利多仪器 （ 上海） 有限公司） ，983G 型红外分光光度 （ 计美国 PERKIN-ELMER 公司） ，S-3400S 扫描电镜（ SEM） （ 日 本日立公司） 。 1. 3 试验方法 1. 3. 1 磷酸化 SPI 的制备
将试验制备所得的粉状样品置于 105℃ 条件下 干燥至恒重，取适量样品粘于观察台上，然后镀膜，置 于 S － 3400N 扫描电镜下，观察其微观结构。
2 结果与分析
2. 1 正交试验方案及结果 依照表 1 的试验水平和 L16 （ 45 ） 的正交表设计试
验方案并进行试验，表 2 为正交试验方案及结果。 2. 2 试验结果的方差分析及工艺优化
第一作者： 硕士研究生（ 迟玉杰教授为通讯作者） 。 * 国家“十一·五”863 计划项目（ 2006AA10Z322） ； 黑龙江省自然
科学基金重点项目（ ZD200902） 收稿日期： 2010 － 07 － 19，改回日期： 2010 － 09 － 15
性环境中的溶解性和乳化性［10］。 本文主要研究采用三聚磷酸钠（ STP） 对 SPI 进
ESI
7. 0，0. 1 mol / L 的磷酸盐缓冲溶液配制 100 mL 10 g /
L（ m / V） 的蛋白悬浮液，取 30 mL 蛋白液于高速匀浆
机中，加入 10 mL 大豆油，10 000 r / min 均质 1 min 以
形成乳浊液，均质后，分别在 0 min 与 10 min 时从底
部吸取 100μL 分散于 10 mL 1 g / L SDS 中，于 500 nm
L16 （ 45 ） 正交试验方案与结果
因素 温度 /℃ 1（ 35） 2（ 40） 3（ 45） 4（ 50） 2 1 4 3 3 4 1 2 4 3 2 1
时间 /h 1（ 2） 2（ 2. 5） 3（ 3） 4（ 3. 5） 3 4 1 2 4 3 2 1 2 1 4 3
误差项 1 2 3 4 4 3 2 1 2 1 4 3 3 4 1 2
处测定吸光度值（ 测定 3 次取平均值） ，以 A0 × 100 表 示乳化活性（ EAI） ，乳化稳定性（ ESI） 的表示方法为：
ESI = A0 × ΔT A0 － A10
式中： ESI 单位为 min； A0 ，0 min 时的吸光度值； ΔT，测定乳化性的 2 次时间间隔，本试验取 10 min；
研究报告
提高大豆分离蛋白乳化性的工艺优化及性质分析*
陈俊高1 ，迟玉杰1，2 ，王喜波1 ，于翠1
1（ 东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨，150030） 2（ 大豆生物学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨，150030）
摘 要 采用三聚磷酸钠（ STP） 对大豆分离蛋白（ SPI） 进行磷酸化改性，通过 L16 （ 45 ） 正交试验设计和 SPSS 分 析软件对工艺条件进行优化，并对磷酸化改性前后的蛋白样品进行疏水性、红外光谱和电镜扫描（ SEM） 3 方面 的分析测定，确认 STP 对 SPI 所产生的磷酸化作用。结果表明： 4 个试验因素对乳化活性（ EAI） 和乳化稳定性 （ ESI） 的影响顺序为 STP 添加量 ＞ SPI 浓度 ＞ 反应时间 ＞ 反应温度； 适宜的磷酸化反应条件为 SPI 浓度 13% ， STP 添加量 10% ，反应温度 40℃ ，反应时间 3. 5 h。在最适工艺条件下，经磷酸化改性后的 SPI 产品的乳化活性 从 0. 293 提高到 0. 785，乳化稳定性从 17. 8 提高到 26. 2，分别提高了 168% 和 47% 。 关键词 大豆分离蛋白，磷酸化，乳化性，工艺，性质
A10 ，10 min 时的吸光度值。 1. 3. 3 磷酸化程度的测定
（ 1） 总磷的测定： 参照 GB / T5009. 87 － 2003 食品
中磷的测定。 （ 2） 无机磷的测定［12］： 准确称取试样 1 g，置于
100 mL 容量瓶中，加 10 mL HCl 和 HNO3 数滴，加水 30 mL，加 入 2 滴 酚 酞，用 NaOH 滴 至 淡 红 色，再 加
采用傅立叶红外光谱仪对上述四种样品进行红 外吸收光谱分析，对磷酸化反应的实质进行验证。分 析方法为： 取适量待测蛋白样品，同磨碎的 KBr 粉末 混合，压片后置于红外光谱仪中全波段（ 400 ～ 4 000 cm － 1 ） 扫描分析，以 KBr 作为空白，每个样品红外光 谱图为多次扫描的叠加图。 1. 5. 3 扫描电镜
常用于改善 SPI 功能性质的方法有物理方法和 化学方法。由于化学方法反应历程短、成本低、设备 要求不高，且改性效果最为明显，因此，化学改性仍然 是目前蛋白质改性的主要手段。常用的化学改性方 法有糖基化、酰化、酸处理、去酰胺和磷酸化等［4 － 6］。 由于磷酸化改性价格低廉、效果较好、对食品蛋白的 消化率无明显影响［7］、安全可靠且能大规模生产，是 提高蛋白功能性的有效手段之一。其作用机理是选 择性利用蛋白质侧链活性基团，如 Ser、Thr 的—OH 或 Lys 的 ε-NH2 ，分别共价连接一个磷酸根，形成— O—PO3 2 － 或—N— PO3 2 － 的酯化反应，继而引进大量 的磷酸根基团［8，9］。在 SPI 分子上导入负电性的磷酸 根基团可以降低蛋白质的等电点，从而改善其在弱酸
行磷酸化改性，对改性阶段工艺参数进行优化，确定 制备高乳化性 SPI 的最佳生产工艺条件，为高乳化型 SPI 粉的生产提供理论依据和技术参考。