・医学检验・
宙
Ｉ＝：＝＝Ｉ ２０１１年１２月第８卷第３６期
颈人乳头瘤病毒第二代杂交捕获法
和实时荧光聚合酶链反应检测法的临床应用比较
王立锋 ， １．苏州大学医学院，江苏苏州２１５００７；２．上海市瑞金医院分院（上海市闵行中心医院）妇产科，上海２０１１００
【摘要】目的：比较第二代杂交捕获法（ＨＣ ＩＩ）与实时荧光聚合酶链反应技术（ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ）在检测女性生殖道人乳 头瘤病毒（ＨＰＶ）高危亚型中的临床价值。方法：随机选取２０１１年１－６月我院妇产科行液基细胞薄层涂片技术进行 低度鳞状上皮内病变（ＬＳＩＬ）检查，检查结果为未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞（ＡＳＣＵＳ）患者１００例，分别采
用ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ与ＨＣ ＩＩ检测ＨＰＶ高危亚型，比较两者的检测结果。对检测ＨＰＶ阳性的样本或ＨＰＶ阴性但液基
细胞薄层涂片技术（ＬＣＴ）≥ＬＳＩＬ的妇女采用阴道镜下活组织病理学检查，以病理结果作为验证两种ＨＰＶ检测的参 考标准。结果：共取病理６８例。病理结果证实该人群中子宫颈上皮内瘤变（ＣＩＮ）ＩＩＩ级５例，ＣＩＮ ＩＩ级１１例，ＣＩＮ Ｉ级
１９例，慢性宫颈炎和鳞状上皮化生３３例。该１００例患者ＨＣⅡ和ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测高危型ＨＰＶ的阳性率分别为
６３．０％和７１．０％，二者总符合率为８２．３％；ＨＣⅡ检测手段对高危宫颈病变患者进行高危ＨＰｖ筛查的灵敏性、特异性、
准确性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比分别为７９．３％、８８．２％、９１．２％、１０．１％、９９．７％、８．９和０．３２７： ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ以上各指标分别为１００．０％、９２．５％、８６．７％、８．６％、１００．０％、８．７和０。结论：Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ与ＨＣⅡ检测宫 颈上皮内瘤变患者高危型ＨＰＶ有较好的相关性；但ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测高危型ＨＰＶ具有更好的敏感性和特异性
【关键词】人乳头瘤病毒；第二代杂交捕获法；实时荧光聚合酶链反应技术；宫颈上皮内瘤变 【中图分类号】Ｒ７１１＿７４ 【文献标识码】Ｂ 【文章编号】１６７３—７２１０（２０１１）１２（ｃ）一０９２—０３
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖａｌｕｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｙｂｒｉｄ ｃａｐｔｕｒｅⅡａｎｄ ｍｕｌｔｉ－ｆｌｕｏｒｅｓ－
ｃｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｈｕｍａｎ ｐａ－
ｐ｜ｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ
ＷＡＮＧ Ｌｉｆｅｈａ＇，
１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｕｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｕｚｈｏｕ ２１５００７，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅ． ｅｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｒｕｉｊｉｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂｒａｎｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｉｎｈａｎｇ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａ１），Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１ １００，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ）ｗｉｔｈ ｈｙｂｒｉｄ ｃａｐｔｕｒｅ １Ｉ（ＨＣⅡ）ｉｎ
ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：１００ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ａｔｙｐｉｃａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｔｅｍｉｎｅｄ（ＴＣＴ Ｉ＞ｌｏｗ ｇｒａｄｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎ，ＬＳＩＬ）ｗｈｏ ｒｅｃｅｉｖｅｄ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｏｕｒ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１ １ ｔｏ Ｊｕｎｅ ２０１ １， ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ＨＣ ＩＩ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｈｉｇｈ—ｒｉｓｋ ＨＰＶ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．ａｎｄ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ
ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：６８ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｗｈｏ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ（ＧＩＮ）， ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ５ ｃａｓｅｓ ｗｅｒｅ ＣＩＮ ＩＩＩ，１ １ ｃｅａｓｅ ｗｅｒｅ ＣＩＮⅡ，１９ ｃａｓｅｓ ｗｅｒｅ ＣＩＮ Ｉ。３３ ｃａｓｅｓ ｗｅｒｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｅｒｖｉｃｉｔｉｓ ａｎｄ
ｓｑｕａｍｏｕｓ ｍｅｔａｐｌａｓｉａ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｈｉｇｈ—ｒｉｓｋ ＨＰＶ ｔｙｐｅｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＨＣ ｌＩ ａｎｄ ｍｕｌｔｉ—ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗｅｒｅ ６３．０％ａｎｄ ７ １．０％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ。ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗａｓ ８２－３％．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．ａｃｃｕ．
ｒａｃｙ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｅｖａｌｕｅ，ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｅｖａｌｕｅ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅ— ｓｉｏｎｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＨＣ Ｉ１ ｗｅｒｅ ７９－３％，８８．２％，９１．２％，１０．１％，９９．７％，８．９ ａｎｄ ０．３２７ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ
ｗｅｒｅ １００．０％，９２．５％，８６．７％，８．６％，１００．Ｏ％，８．７ ａｎｄ ０ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒｅ ａｙｅ ｇｏｏｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＨＣ ＩＩ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉ——ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｌ——ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ——ｒｉｓｋ ＨＰＶ ｔｙｐｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ
ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ—ｒｉｓｋ ＨＰＶ ｈａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；Ｈｙｂｒｉｄ ｃａｐｔｕｒｅⅡ；Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ
ｎｅｏｐｌａｓｉａ
宫颈癌作为一种危害妇女健康的严重疾病，目前在妇女 中其发病率则仅次于乳腺癌的发病率，位于妇女恶性肿瘤发
病的第２位，每年全世界约有５０万新发病例，２５万死亡病
例，其中发展中国家占２／３。我国是宫颈癌的高发区，占全球
宫颈癌总数的１０％ｔ 。研究证实，人乳头状瘤病毒（ＨＰＶ）是 引起妇女宫颈癌及癌前病变发病的致病病毒；研究证实子宫
颈上皮内瘤变（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ，ＣＩＮ）患者多
数伴ＨＰＶ感染．调查发现妇女宫颈癌患者标本中ＨＰＶ—ＤＮＡ
９２巾一蠢药辱掘ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＨＥＲＡＬＤ 的可检出率为９０．０％～９９．７％，特别是那些高危型ＨＰＶ感染。
国际癌症研究组织（ＩＡＲＣ）对世界２５个国家（不包括东亚地
区）的宫颈癌标本的研究发现了１５种高危型ＨＰＶ。而与我国
宫颈癌密切相关主要病毒类型依次为ＨＰＶ１６、ＨＰＶ５８和 ＨＰＶ１８，ＨＰＶ５８是我国、Ｅｔ本、朝鲜等东亚地区高发病毒流行
株［６－９１。所以对存在ＣＩＮ患者进行高危型ＨＰＶ感染的筛查检
测在临床上对于早期预防及发现宫颈癌具有十分重要的临
床意义。第二代杂交捕获法（
ＨＣⅡ）是目前被ＦＤＡ唯一批 ２０１１年１２月第８卷第３６期
准的ＨＰＶ感染检测方法．其具有能同时检测ｌ３种高危型
ＨＰＶ感染的方法。近年来，一种新的ＤＮＡ检测技术实时荧光
聚合酶链反应技术ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ）检测获得很大的发展，ｒｅａｌ—
ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测高危型ＨＰＶ ＤＮＡ具有试验操作简便，在扩增
高危型ＨＰＶ时结合了核酸特异型探针以进行杂交，该方法
提高了实验室检测的敏感性及特异性 。本研究采用ｒｅａｌ—
ｔｉｍｅ ＰＣＲ和ＨＣⅡ技术来分别检测１００例行液基细胞薄层
涂片技术（ＴＣＴ）≥低度鳞状上皮内病变（ＬＳＩＬ），未明确诊断 意义的不典型鳞状上皮细胞（ＡＳＣＵＳ）患者宫颈标本中的高
危亚型ＨＰＶ，探讨两种检测方法的优缺点及其不同ＣＩＮ程度 的高危型ＨＰＶ的检出率。并探讨两种高危ＨＰＶ检测方法在
宫颈癌筛查中的作用。
１材料与方法
１．１材料 标本来源于２０１１年１～６月在上海市闵行区中心医院妇
产科行液基细胞薄层涂片技术（ＬＣＴ）≥未明确诊断意义的
ＡＳＣＵＳ患者１００例。检查者按细胞学分类，ＡＳＣＵＳ ４８例，
ＬｓＩＬ ３６例，高度鳞状上皮内病变（ＨＳＩＬ）１６例。分别采用ｒｅａｌ－
ｔｉｍｅ ＰＣＲ与ＨＣⅡ检测高危型ＨＰＶ。及时将临床采集的标本
送检．按照操作流程预处理临床采集的标本后置于低温冰箱
保存待检。所有患者均对研究知情。
１．２仪器与试药 高危型ＨＰＶ实时荧光ＰＣＲ临床检测试剂盒均由上海 复星诊断有限公司所提供：采用Ｌｉｎｅ—Ｇｅｎｅ ＦＱＩＮ３３ Ａ型ｒｅ．
ａｌｔｉｍｅ—ＰＣＲ仪进行ＤＮＡ检测：ＨＣⅡ基因杂交信号扩大系
（美国Ｄｉｇｅｎｅ公司）、ＨＰＶ—ＤＮＡ试剂盒（美国Ｄｉｇｅｎｅ公司）、 微孔板封面胶膜（Ｘｙｇｅｎ公司）、子宫颈采样器（含保存液）
（美国Ｄｉｇｅｎｅ公司）、圆底９６孔酶标板（Ｘｙｇｅｎ公司）。
１．３实时荧光聚合酶链反应技术检测方法 不同引物和探针（５ 端和３ 端分别标有荧光报告基团
和荧光淬灭基团），只在相应型别模板的型特异性碱基区域与
模板发生相互作用，ＰＣＲ扩增时，兼有５＂－３ 核酸外切酶活性
的Ｔａｑ酶将探针降解，荧光报告基团脱离荧光淬灭基团的作
用．荧光信号逐渐增强，由定量ＰＣＲ仪的荧光监测系统对标 本的荧光信号进行实时动态检测，确定模板的型别。ｒｅａｌ—
ｔｉｍｅ ＰＣＲ法高危型ＨＰＶ检测反应试剂盒可分辨１３种高危
型ＨＰＶ型别（包括１６、１８、３１、３３、３５、３９、３２、５２、５６、５８、５９、６８）。 具体操作流程按试剂盒说明书指示的步骤进行操作。其操作 流程包括如下步骤：①提取样本ＤＮＡ。②配制ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ
反应液：将每ｌ份样本标本分别分装到１３个ＰＣＲ反应管中 以分别检测１３种高危型ＨＰＶ型别。③样本实时荧光ＰＣＲ
扩增与检测：扩增过程为５０℃反应进行２ ｍｉｎ，在９４℃条件
下进行ＤＮＡ变性２进入ＰＣＲ反应循环，循环温度及时问程 序为９３℃，２０ Ｓ，５０℃，９０ ｓ，共计４０个反应循环，反应温度降 至５０℃时检测反应荧光值。④对反应结果进行判断分析。
１．４第二代杂交捕获检测方法
ＨＣ ＩＩ可同时检测１３种高危型ＨＰＶ（包括ｌ６、１８、３１、 ３３、３５、３９、３２、５２、５６、５８、５９、６８），按照试剂上所述的操作步骤
进行，其具体操作步骤如下：将ＤＮＡ双链解链为单链ＤＮＡ：
将解链的ＤＮＡ和ＲＮＡ探针进行杂交，生成ＲＮＡ—ＤＮＡ杂交
体；ＲＮＡ—ＤＮＡ杂交体和微孔壁上固定的特异性抗体相结
合；结合的抗体进行磷酸化反应将信号放大；底物在碱性磷 ・医学检验・
酸酶的作用下发光，利用读数器读取发光的强弱来判定微孑Ｌ
壁上碱性磷酸酶的含量，进而得出特异性结合的ＲＮＡ—ＤＮＡ
杂交体的具体含量；最后进行反应结果的读取，判断标准：ＨＰＶ
负荷量≥１．０ ｐｇ／ｍｌ，则定义为ＨＰＶ感染阳性。 １．５病理判断
阴道镜下多点活检病理学检测：对于检测ＨＰＶ阳性．或
ＨＰＶ阴性但ＴＣＴ≥ＬＳＩＬ的病例均行阴道镜下多点活检或颈
管诊刮。病理学家在完全不知道ＴＣＴ和ＨＰＶ结果的情况下
盲法阅片做出诊断。 １．６统计学方法
所以统计分析处理均采用ＳＰＳＳ １１．０统计软件包进行。
计量资料采用均数４－标准差（露±ｓ）表示，组间比较采用ｔ检验，
计数资料采用百分率表示，组间对比采用ｘｚ检验。以Ｐ＜０．０５
为差异具有统计学意义。
２结果
２．１／，－＃ｂ头瘤病毒检出率及不同程度宫颈病变两种人乳头瘤
病毒检出状况 本组诊断ＣＩＮ ３５例，ＣＩＮ现患率为３５％（３５／１００），其中，
≥ＣＩＮⅡ１６例，占１６％（１６／１００）。６８例病理结果以及两种
ＨＰＶ检出情况见表１。
表１ 两种方法检测不同程度宫颈病变中人乳头瘤病毒阳性率比较【ｎ（％）】
…法 合计
ＨＣ １Ｉ检测ＨＰＶ（＋）１５（７８．９）１０（９０．９）５（１００．０） １２（３６．３）４２（６１．８） ＰＣＲ检测ＨＰＶ（＋）１７（８９．５）１ １（１００．０）５（１００．０） １９（５７．６）５２（７６．５）
２．１两种方法检测宫颈病变的符合率
两种方法的总符合率为８２．３％，Ｋａｐｐａ指数为０．５７９，见
表２。
表２两种方法检测宫颈病变符合率比较（例）
注：“一”表示无数据
２．２两种方法检测高危型人乳头瘤病毒的阳性率比较
ＨＣⅡ和ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测高危型ＨＰＶ的阳性率分别 为６３．０％（６３／１００）和７１．０％（７１／１Ｏ０），两者比较差异有统计学
意义（Ｐ＜Ｏ．０５）。 ２．３两种人乳头瘤病毒检测方法的评价
以病理结果为参照标准，评价两种ＨＰＶ检测方法对预 测高度ＣＩＮ（ＣＩＮＩＩ以上病变）的临床价值，其临床评价指标
见表３。
３讨论
宫颈癌是威胁妇女健康的主要恶性肿瘤之一．目前发现
的ＨＰＶ基因型有１００余种，大约４０种涉及生殖道感染，约
２０种与肿瘤发生有关。依据ＨＰＶ致病能力的不同，ＨＰＶ可
分为低危型和高危型，当前的流行病学数据证实，宫颈癌及
ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＨＥＲＡＬＤ巾量医药售攉
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