专业前沿知识讲座综述论文假单细胞株M18专业：生物工程姓名：陈莹学号：20103304假单胞菌株M18（Pseudomonas sp.M18）是从上海郊区甜瓜根际分离筛选到的一株具有生物防治功能的假单胞菌新种，其生防作用部分归功于其分泌的包括】假单胞菌株M18(Pseudomonassp. M18)是从甜瓜根际土壤中分离获得的一株对多种植物病原菌具有显著拮抗作用的菌株,在菌群传感(quorum sensing)系统的调控下,能分泌吩嗪-1-羧酸(PCA)以及多种吩嗪(phz)类衍生物的抗真菌物质。
全局性因子GacA是M18菌株吩嗪类物质的合成与菌群传感系统的重要调控因子,本文将就GacA对上述两者的调控做进一步研究。
【方法】PCR基因扩增和测序研究M18菌株中PCA合成基因簇,运用RT-PCR及构建phzA-lacZ转录融合手段研究M18菌株中两个phz 基因簇各自的转录特征以及受全局性因子GacA的调控作用,运用翻译融合手段进一步研究M18菌株中GacA 对菌群传感系统的调控作用。
【结果】M18菌株的染色体中存在着两个PCA合成基因簇phzA1-G1和phzA2-G2,与铜绿假单胞菌株(P.aeruginosa)PAO1的一致性达99%。
但是,M18菌株phzA2-G2基因簇下游的非编码区与PAO1菌株不同,存在着三段单位长度为144 bp的重复序列;在野生菌株M18中,phzA1-G1的转录水平明显高于phzA2-G2,GacA促进phzA1-G1转录,抑制phzA2-G2转录,区别性地调控两个phz基因簇的转录,GacA在整体上抑制phz基因簇的转录,与PAO1菌株中,GacA对phz的调控方式相反;gacA基因突变对菌群传感系统中lux家族基因中的lasI表达量无显著影响,但正调控las系统下游的rhlI表达量,GacA对phz 基因簇表达的调控部分通过菌群传感系统实现。
【结论】在M18菌株和PAO1菌株中,GacA对吩嗪类产物合成的调控方式相反,对菌群传感系统的调控也存在着差异性,这些差异可能是两个菌株在各自不同生境１摘要假单胞菌株M18（Pseudomonas sp.M18）是从上海郊区甜瓜根际分离筛选到的一株具有生物防治功能的假单胞菌新种，其生防作用部分归功于其分泌的包括藤黄绿脓菌素（pyoluteorin，Plt）和吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA）在内的多个抗生物质。
本研究试图在分子水平上了解M18菌株中phz合成基因簇的组成及GacA对M18菌株phz合成基因簇及菌群传感系统的调控。
本研究内容主要包括三个方面：第一方面，根据假单胞菌株M18兼有荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌的遗传学背景，而且假单胞菌株M18与铜绿假单胞菌均可以产生PCA，推测M18菌株与铜绿假单胞菌具有类似的phz合成基因簇。
据此，设计保守引物并扩增得到M18的phz合成基因簇，序列分析显示，假单胞菌株M18与铜绿假单胞菌株PAO1 （Pseudomonas aeruginosa PAO1）中的phz合成基因簇高度相似，各功能基因的同源性均在99%以上。
但是，M18菌株phzA2-G2基因簇下游的非编码区与PAO1菌株不同，存在着三段单位长度为144bp的重复序列，说明M18菌株与PAO1菌株在遗传上存在着差异。
第二方面，运用RT-PCR及构建phzA-lacZ转录融合，研究了M18菌株中两个phz基因簇的表达特点以及全局性因子GacA的调控作用。
结果表明，在野生菌株M18中，phzA1-G1的表达量要明显高于phzA2-G2，GacA促进phzA1-G1表达，抑制phzA2-G2表达，区别性地调控两个phz基因簇的表达，但是，GacA在整体上抑制phz基因簇的表达，这与PAO1菌株中，GacA对phz基因簇的调控方式相反。
第三方面，进一步研究了M18菌株中GacA对菌群传感（quorum sensing）系统的调控作用，表明gacA基因突变对菌群传感系统中lux家族基因中的lasI表达量无显著影响，但正调控las系统下游的rhlI表达量。
结合本实验室已有的las及rhl系统对PCA的调控形式研究，说明GacA对phz基因簇表达的调控主要不通过las及rhl菌群传感系统实现。
在M18菌株和PAO1菌株中，GacA对吩嗪类产物合成及菌群传感系统的差异性调控可能是两个菌株在各自不同生境期进化的结果。
I假单胞菌株M18吩嗪合成基因簇表达调控及其产物发酵优化研究摘要假单胞菌M18（Pseudomonas sp.M18）分离自上海郊区甜瓜根际，能够分泌具有广谱抑菌活性的次生代谢物吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA），是一株具有生物防治功能的新型菌株。
现已证实PCA合成受到全局性双元调控系统GacA/GacS、群体感应（Quorum sensing，QS）系统及环境条件等多种因素的影响。
本研究从分子水平上分析了M18菌株中phz合成基因簇的特点，阐明了GacA/GacS和QS系统对M18菌株中吩嗪合成基因簇（phz）的调控作用；并进一步从细胞水平上研究环境条件对PCA合成的影响，进而通过发酵培养基营养组分的优化，分批发酵及流加发酵优化控制等策略逐步提高PCA产量，旨在为实现PCA商业化应用提供理论依据和技术支持。
主要包含三部分：第一、确定菌株M18中含有两个吩嗪合成基因簇假单胞菌株M18兼有荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌的遗传学背景，而且假单胞菌株M18与铜绿假单胞菌均可以产生PCA，推测M18菌株与铜绿假单胞菌具有类似的phz合成基因簇。
据此，设计保守引物并扩增得到M18的phz合成基因簇及两侧序列，序列分析显示：假单胞菌株M18与铜绿假单胞菌株PAO1 （Pseudomonas aeruginosa PAO1）中的两个phz合成基因簇高度相似，结构基因及两侧修饰基因的同源性均在99%以上；不同的是，M18菌株phz2基因簇的下游多出三段144bp的重复序列。
根据两个phz基因簇phz1和phz2上游调控区序列的差异设计引物，以M18菌株为出发菌株分别构建phz1和phz2基因簇失活突变株，研究菌株M18的两个phz基因簇的表达特点及对产物PCA合成的影响，结果表明：phz2基因簇对PCA合成起主要贡献，且受环境条件影响。
这意味着假单胞菌M18虽与铜绿假单胞菌PAO1有较为相似的遗传学背景，但在调控PCA的合成表达方面仍存在一定的差别。
第二、菌株M18吩嗪合成的分子调控机制（1）基于全局调控系统GacA/GacS中的gacA突变株M18G，分别构建了基因簇phz1和phz2失活的双突变株M18GP1和M18GP2，研究了全局性调控元件GacA在PCA合成中的调控作用。
运用荧光定量PCR(qRT-PCR)和转录融合(phz-lacZ)活性测定表明，在野生菌株M18中，GacA在转录水平促进phz1基因簇表达，但抑制phz2基因簇表达，从而有选择性地调控两个phz基因簇的表达；菌株M18的gacA基因抑制PCA合成，这与所报道的PAO1菌株中GacA促进phz基因簇表达的调控方式相反。
（2）研究了两个phz基因簇调控区域及GacA/GacS如何调控两个基2）研究了两个phz基因簇调控区域及GacA/GacS如何调控两个基因簇的表达。
首先运用5’-RACE方法确定了基因簇phz1和phz2的转录起始位点；其次对两个phz基因簇调控区进行系统性缺失并与lacZ构建融合。
通过β-半乳糖苷酶活性测定表明，基因簇phz1启动子下游1～90bp调控区域使其基因表达活性下降10倍，phz2启动子下游1~131bp调控区均存在抑制子使表达活性降低2~3倍，各融合片段转化到gacA突变的菌株M18G中，结果表明：GacA负调控phz2的表达，对phz1表达活性基本没有影响。
因此，菌株M18中GacA在转录和转录后水平促进phz2表达，从而促进PCA合成。
（3）进一步研究群体感应LasR和RhlR系统对两个phz基因簇的调控作用表明，RhlR蛋白正调控phz1和phz2表达，而LasR有区别性调控两个基因簇的表达，即正调控phz1表达，但负调控phz2表达。
相应地，在M18菌株中，RhlR促进PCA合成，LasR则抑制PCA合成，这一结果和菌株PAO1中LasR促进吩嗪PYO的合成相反。
菌株M18和菌株PAO1中，GacA/GacS和群体感应系统不同的调控方式及引起的吩嗪类产物合成的差异性可能归结于它们在不同生境的选择压力下长期进化的结果。
（4）GacA/GacS负调控M18中PCA合成，gacA基因突变株M18G中PCA合成提高了30倍。
以此为基础，研究不同环境条件对GacA/GacS介导的PCA合成的调控表明，野生型菌株M18中的PCA双元调控系统GacA/GacS对高温、高浓度氧、偏酸或偏碱性环境敏感；而缺失全局调节子GacA的突变株M18G能显著提高对敏感环境的耐受性。
模拟根际环境中的不同营养因子对PCA合成荧光假单胞菌的重要抗菌机制是产生抗生素,它分泌的抗生素主要有:吩嗪-1-羧酸(PCA)、2,4-二乙酰藤黄酚(PHL)、藤黄绿菌素(PLT)、硝吡咯菌素(Prn)和HCN[1]5种.PCA等吩嗪类物质在细胞内可作为电子载体,传递电子到目标细胞,从而增加了细胞内的超氧化物自由基,使目标细胞中毒死亡[2].吩嗪类化合物可用于肺结核、白内障、结核杆菌、非典型耐酸杆菌及麻风病等疾病的治疗,对小麦全蚀病、水稻枯萎病病原菌也有显著的抑制作用.二羧基吩嗪是吩嗪合成途径的第一个产物.随着荧光假单胞菌30-84和致金色假单胞菌2-79中PCA生物合成相关基因的克隆,人们发现:不同的假单胞菌在PCA合成上具有相似的基因系统[3,4].尽管利用PCA控制农作物的根部疾病已经在大田和大棚实验中取得成功,但PCA并没有正式地用于农作物的疾病防治,其障碍之一就是缺乏廉价的大规模发酵技术.Slininger等[5,6]对荧光假单胞菌2-79产PCA的营养条件、温度、酸度进行了研究,为PCA生产提供了有价值的数据.文献[7]从上海郊区甜瓜地的根际土壤中分离到荧光假单胞菌株M18,它同时具有广谱抑制植物真菌性病原菌和促。