第23章三羧酸循环(生物化学下册p92) 3学时学习重点：◆熟悉柠檬酸循环途径中的各步酶促反应，以及各步反应酶的作用特点。

◆会分析和计算酵解和柠檬酸循环中产生的能量，以及底物分子中标记碳的去向。

葡萄糖的有氧氧化包括四个阶段。

①糖酵解产生丙酮酸（2丙酮酸、2ATP、2NADH）②丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA③三羧酸循环（CO2、H2O、A TP、NADH）④呼吸链氧化磷酸化（NADH-----ATP）三羧酸循环：乙酰CoA经一系列的氧化、脱羧，最终生成CO2、H2O、并释放能量的过程，又称柠檬酸循环、Krebs循环。

原核生物：①~④阶段在胞质中真核生物：①在胞质中，②~④在线粒体中一、丙酮酸脱羧生成乙酰CoA1、反应式：2、丙酮酸脱氢酶系丙酮酸脱氢酶系是一个十分庞大的多酶体系，位于线粒体膜上，电镜下可见。

E.coli丙酮酸脱氢酶复合体：分子量：4.5×106，直径45nm，比核糖体稍大。

酶辅酶每个复合物亚基数丙酮酸脱羧酶（E1）TPP 24二氢硫辛酸转乙酰酶（E2）硫辛酸24二氢硫辛酸脱氢酶（E3）FAD、NAD+12此外，还需要CoA、Mg2+作为辅因子这些肽链以非共价键结合在一起，在碱性条件下，复合体可以解离成相应的亚单位，在中性时又可以重组为复合体。

所有丙酮酸氧化脱羧的中间物均紧密结合在复合体上，活性中间物可以从一个酶活性位置转到另一个酶活性位置，因此，多酶复合体有利于高效催化反应及调节酶在反应中的活性。

3、反应步骤反应过程（1）丙酮酸脱羧形成羟乙基-TPP（2）二氢硫辛酸乙酰转移酶（E2）使羟乙基氧化成乙酰基（3）E2将乙酰基转给CoA，生成乙酰-CoA（4）E3氧化E2上的还原型二氢硫辛酸（5）E3还原NAD+生成NADH4、丙酮酸脱氢酶系的活性调节从丙酮酸到乙酰CoA是代谢途径的分支点，此反应体系受到严密的调节控制，此酶系受两种机制调节。

（1）可逆磷酸化的共价调节丙酮酸脱氢酶激酶（E A）（可被ATP激活）丙酮酸脱氢酶磷酸酶（E B）磷酸化的丙酮酸脱氢酶（无活性）去磷酸化的丙酮酸脱氢酶（有活性）（2）别构调节ATP、CoA、NADH是别构抑制剂ATP抑制E1CoA抑制E2NADH抑制E35、能量1分子丙酮酸生成1分子乙酰CoA，产生1分子NADH（2.5A TP）。

二、三羧酸循环（TCA）的过程TCA循环：每轮循环有2个C原子以乙酰CoA形式进入，有2个C原子完全氧化成CO2放出，分别发生4次氧化脱氢，共释放10A TP。

1、反应步骤概述三羧酸循环（图，见书）（1）、乙酰CoA+草酰乙酸→柠檬酸柠檬酸合酶，TCA中第一个调节酶：受ATP、NADH、琥珀酰CoA、和长链脂肪酰CoA 的抑制；受乙酰CoA、草酸乙酸激活。

柠檬酸合酶上的两个His残基起重要作用：一个与草酰乙酸羰基氧原子作用，使其易受攻击；另一个促进乙酰CoA的甲基碳上的质子离开，形成烯醇离子，就可与草酰乙酸缩合成C-C键，生成柠檬酰CoA，后者使酶构象变化，使活性中心增加一个Asp残基，捕获水分子，以水解硫酯键，然后CoA和柠檬酸相继离开酶。

氟乙酰CoA可与草酰乙酸生成氟柠檬酸，抑制下一步反应的酶，据此，可以合成杀虫剂、灭鼠药。

氟乙酸本身无毒，氟柠檬酸是乌头酸酶专一的抑制剂，氟柠檬酸结合到乌头酸酶的活性部位上，并封闭之，使需氧能量代谢受毒害。

它存在于某些有毒植物叶子中，是已知最能致死的简单分子之一。

LD50为0.2mg/Kg体重，它比强烈的神经毒物二异丙基氟磷酸的LD50小一个数量级。

（2）、柠檬酸→异柠檬酸这是一个不对称反应，由顺鸟头酸酶催化顺乌头酸酶只能以两种旋光异构方式中的一种与柠檬酸结合，结果，它催化的第一步脱水反应中的氢全来自草酰乙酸部分，第二步的水合反应中的OH也只加在草酰乙酸部分。

这种酶与底物以特殊方式结合（只选择两种顺反异构或旋光异构中的一种结合方式）进行的反应称为不对称反应。

结果，TCA第一轮循环释放的CO2全来自草酰乙酸部分，乙酰CoA 羰基碳在第二轮循环中释放，甲基碳在第三轮循环中释放50%，以后每循环一轮释放余下的50%。

柠檬酸上的羟基是个叔醇，无法进一步被氧化。

因此，柠檬酸需转变成异柠檬酸，将不能被氧化的叔醇，转化成可以被氧化的仲醇。

90%柠檬酸、4%顺乌头酸、6%异柠檬酸组成平衡混合物，但柠檬酸的形成及异柠檬酸的氧化都是放能反应，促使反应正向进行。

（3）、异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸和NADH这是三羧酸循环中第一次氧化脱羧反应，异柠檬酸脱氢酶，TCA中第二个调节酶：Mg2+（Mn2+）、NAD+和ADP可活化此酶，NADH和A TP可抑制此酶活性。

细胞在高能状态：A TP/ADP、NADH/NAD+比值高时，酶活性被抑制。

线粒体内有二种异柠檬酸脱氢酶，一种以NAD+为电子受体，另一种以NADP+为受体。

前者只在线粒体中，后者在线粒体和胞质中都有。

（4）、α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA和NADHα-酮戊二酸脱氢酶系，TCA循环中的第三个调节酶：受NADH、琥珀酰CoA、Ca2+、ATP、GTP抑制α-酮戊二酸脱氢酶系为多酶复合体，与丙酮酸脱氢酶系相似（先脱羧，后脱氢）（5）、琥珀酰CoA生成琥珀酸和GTP琥珀酰CoA合成酶（琥珀酸硫激酶）这是TCA中唯一的底物水平磷酸化反应，直接生成GTP。

在高等植物和细菌中，硫酯键水解释放出的自由能，可直接合成ATP。

在哺乳动物中，先合成GTP，然后在核苷二磷酸激酶的作用下，GTP转化成A TP。

（6）、琥珀酸脱氢生成延胡索酸（反丁烯二酸）和FADH琥珀酸脱氢酶是TCA循环中唯一嵌入线粒体内膜的酶。

丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，可阻断三羧酸循环。

（7）、延胡索酸水化生成L-苹果酸延胡索酸酶具有立体异构特性，OH只加入延胡索酸双键的一侧，因此只形成L-型苹果酸。

（8）、L-苹果酸脱氢生成草酰乙酸和NADHL-苹果酸脱氢酶平衡有利于逆反应，但生理条件下，反应产物草酰乙酸不断合成柠檬酸，其在细胞中浓度极低，少于10-6mol/L，使反应向右进行。

2、TCA循环小结（1）、三羧酸循环示意图（标出C编号的变化）（2）、总反应式：丙酮酸+ 4NAD+ + FAD + GDP →4NADH + FADH2 + GTP + 3CO2 + H2O乙酰CoA + 3NAD+ + FAD + GDP →3NADH + FADH2 + GTP + 2CO2 + H2O（3）、一次底物水平的磷酸化、二次脱羧反应，三个调节位点，四次脱氢反应。

3NADH、FADH2进入呼吸链（4）、三羧酸循环中碳骨架的不对称反应同位素标记表明，乙酰CoA上的两个C原子在第一轮TCA上并没有被氧化。

被标记的羰基碳在第二轮TCA中脱去。

在第三轮TCA中，两次脱羧，可除去最初甲基碳的50%，以后每循环一次，脱去余下甲基碳的50%问题：标记Glucose的第二位碳原子，跟踪EMP、TCA途径，C2的去向。

3、一分子Glc彻底氧化产生的ATP数量净产生：30或32 ATP甘油磷酸穿梭，1个NADH生成1.5个ATP苹果酸穿梭，1个NADH生成2.5个A TP4、三羧酸循环的代谢调节三羧酸循环的调节（图，见书）（1）、柠檬酸合酶（限速酶）受A TP、NADH、琥珀酰CoA及脂酰CoA抑制。

受乙酰CoA、草酰乙酸激活（2）、异柠檬酸脱氢酶NADH、ATP可抑制此酶ADP可活化此酶，当缺乏ADP时就失去活性。

（3）、α-酮戊二酸脱氢酶受NADH和琥珀酰CoA抑制。

三、TCA的生物学意义1、提供能量线粒体外的NADH，可通过3-磷酸甘油穿梭和苹果酸穿梭机制，运到线粒体内，经呼吸链再氧化，这两种机制在不同组织的细胞中起作用。

（1）、磷酸甘油穿梭机制：磷酸二羟丙酮+NADH+H+→3-磷酸甘油+NAD+3-磷酸甘油进入线粒体，将2H交给FAD而生成FADH2，FADH2可传递给辅酶Q，进入呼吸链，产生2A TP（3-磷酸甘油脱氢酶的辅酶是FAD）。

（2）、苹果酸穿梭机制：胞液中NADH可经苹果酸酶催化，使草酰乙酸还原成苹果酸，再通过苹果酸-α-酮戊二酸载体转运，进入线粒体，由线粒体内苹果酸脱氢酶催化，生成NADH和草酰乙酸，NADH 进入呼吸链氧化，生成3A TP。

（苹果酸脱氢酶的辅酶是NAD+）1分子Glc在肝、心中完全氧化，产生38A TP，在骨骼肌、神经系统组织中，产生36ATP。

2、TCA是生物体内其它有机物氧化的主要途径，如脂肪、氨基酸、糖3、TCA是物质代谢的枢纽一方面，TCA是糖、脂肪、氨基酸等彻底氧化分解的共同途径，另一方面，循环中生成的草酰乙酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、琥珀酰CoA和延胡索酸等又是合成糖、氨基酸、脂肪酸、卟啉等的原料，因而TCA将各种有机物的代谢联系起来。

TCA是联系体内三大物质代谢的中心环节，为合成其它物质提供C架。

四、TCA的回补反应三羧酸循环中间物的的回补在TCA循环中，有些中间产物是合成其它物质的前体，如卟啉的主要碳原子来自琥珀酰CoA，Glu、Asp可以从α-酮戊二酸和草酰乙酸衍生而成，一旦草酰乙酸浓度下降，则会影响TCA循环，因此这些中间产物必须不断补充，以维持TCA循环。

产生草酰乙酸的途径有三个：（1）、丙酮酸羧化酶催化丙酮酸生成草酰乙酸丙酮酸羧化酶是一个调节酶，乙酰CoA可以增加其活性。

需要生物素为辅酶（2）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸在脑、心脏中存在这个反应。

（3）、Asp、Glu转氨可生成草酰乙酸和α-酮戊二酸Ile、Val、Thr、Met也会形成琥珀酰CoA，最后生成草酰乙酸。

思考与练习1.尽管O2没有直接参与柠檬酸循环，但没有O2的存在，柠檬酸循环就不能进行，为什么？2.假如你将甲基C用14C标记的丙酮酸添加到线粒体的悬浮液中，那么一轮柠檬酸循环后，14C是在草酰乙酸的什么位置？为了使所有14C以14CO2释放掉，需要进行多少轮柠檬酸循环（除了第一轮丙酮酸是标记的以外，以后进入柠檬酸循环的丙酮酸都不是标记的）？3.增加以下各分子的浓度会对柠檬酸循环的速度有什么影响？（1）辅酶A （2）乙酰辅酶A （3）NAD+4.利用分离出的线粒体可以研究细胞呼吸，可测定各种不同状况下氧的消耗，如果将0.01M 的丙二酸钠添加正在进行细胞呼吸的线粒体（以丙酮酸为燃料来源）中，呼吸作用很快就会停止，并造成代谢中间产物的堆积。

（a）堆积的中间代谢物是什么？（b）解释为什么会堆积？（c）解释氧消耗为什么会停止？（d）除了除去丙二酸解除抑制以外，还有什么方法可以克服丙二酸的抑制？5.假设天冬氨酸是供给细胞的唯一碳源，请概述线粒体中柠檬酸循环得以进行的反应？。