•
• • • • •
•
• • •
•
1.5 Western blot法测定肺组织p-Akt及p-p70S6K 提取细胞总蛋白质，以BCA法进行蛋白定量。 按每孔100µg蛋白量加样进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离的蛋白转膜至PVDF膜，以5%脱脂奶 粉室温封闭1 h，分别加兔抗大鼠p瑼kt多克隆抗体(1:1 000)或兔抗大鼠β-actin抗体(1:1 000)，于4 ℃过夜。以三羟甲基氨基甲烷缓冲液（TBS）洗膜后加辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（1:2 000）， 于室温孵育1 h，洗膜，用ECL显影。用Quantity One凝胶软件分析系统分析p-Akt蛋白和内参βactin光密度值，以目的蛋白p-Akt条带光密度和内参β-actin光密度比值代表p-Akt的光密度值。 Western Blot检测p-p70S6K蛋白时，一抗孵育分别予兔抗大鼠p70S6K及p-p70S6K多克隆抗体，以 p-p70S6K条带光密度和p70S6K光密度比值代表p-p70S6K的光密度值，其余步骤均同p-Akt。 1.6 统计学处理方法 组间比较采用单因素方差分析，进行方差齐性检验，方差齐者用LSD， 方差不齐者用Dunnet’s T3法检验。两变量的相关程度用直线相关分析法分析。 2 结果 2.1 肺组织显微结构改变 光镜下可见C组大鼠支气管上皮完整，无明显炎症反应，肺组织形态 正常；A组大鼠支气管上皮脱落，支气管壁和血管壁周围有大量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞和 淋巴细胞为主，平滑肌层明显增厚，管腔狭窄；W组炎症反应较轻，气道壁各层（尤其是平滑肌层） 厚度较A组明显降低（见图1）。 2.2 支气管壁厚度、平滑肌层厚度比较 各组大鼠支气管基底膜周径(Pbm)比较差异无显著性 （P >0.05），说明所测量的支气管平均大小相似，各组支气管壁厚度（Wat）、平滑肌层厚度 （Wam）具有可比性。各组大鼠支气管壁厚度、平滑肌层厚度测定结果见表1。
• • •
•
பைடு நூலகம்
•
1 材料和方法 1.1 实验动物 SPF级健康雄性Sprague-Dawlay（SD）大鼠36只，6～8周龄，体重（200±10） g，由温州医学院实验动物中心提供。饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12 h。 1.2 主要试剂及药品 卵白蛋白（OVA）为Sigma公司产品，wotmannin为Biomol公司产品，兔 抗大鼠磷酸化Akt多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均为美国CST产品，兔抗大鼠 p70S6K多克隆抗体、兔抗大鼠磷酸化p70S6K多克隆抗体及兔抗大鼠β-actin多克隆抗体均为Santa Cruz产品。 1.3 哮喘大鼠气道重塑模型复制 SPF级雄性健康SD大鼠36只，随机分为3组（n=12），分别 为：正常对照组（C组）、哮喘组（A组）以及wortmannin（W组）。大鼠哮喘模型参照文献[2-3] 方法建立并稍加改进：第1天腹腔内注射10%的OVA和10%的氢氧化铝混合液1 mL，第8天以相同 剂量、相同方法加强致敏1次；致敏后第15天开始予1%OVA雾化吸入刺激，每周3次，每次30 min， 连续8周。C组则代以生理盐水致敏和激发大鼠；W组致敏阶段同哮喘组，激发阶段在每次激发前半 小时腹腔注射wortmannin (15µg/kg)。 1.4 肺组织显微结构观察及支气管壁厚度和支气管平滑肌厚度测定 肺组织进行石蜡包埋切片 及HE染色，光镜下观察支气管及血管周围的炎性细胞浸润情况、支气管上皮损伤情况和支气管平 滑肌层是否增厚等情况。应用Image-Pro plus 6.0医学图像分析软件，在200倍光镜下，每只大鼠挑 选3支有完整横断面的中小支气管，参照文献[4]关于气道各层定义寻找标志，测量支气管基底膜周 径(Pbm)、支气管总面积（Wat1）、管腔面积（Wat2）、平滑肌外缘内气管面积（Wam1）、平滑 肌内缘内气管面积（Wam2）。计算标准化总管壁厚度（Wat）为（Wat1璚at2）/Pbm，标准化平 滑肌厚度（Wam）为（Wam1璚am2）/Pbm[5]。最后计算3个Pbm、Wat、Wam数据平均值作为该 标本代表值。
内容提要： 内容提要：
• • • • • • • • • • • • 第一章 绪论 细胞信号转导的研究对象和研究意义，细胞信号的主要种类，细胞化学信号分子与信 号传递途径的特征。 第二章 受体及跨膜信号转换 受体的概念及特征，细胞内核受体的作用机制，细胞表面受体的种类与结构，细胞表 面受体的跨膜信号转换，受体的研究方法。 第三章 G蛋白与跨膜信号转导 蛋白与跨膜信号转导 G蛋白概述，异三聚体G蛋白，小G蛋白家族，G蛋白的生物学意义。 第四章 环核苷酸第二信使及其胞内信号传递途径 cAMP的发现及第二信使学说的提出，cAMP的产生与灭活，cAMP依赖的下游蛋白质 磷酸化，cAMP信号传递模型，cAMP信号调节的细胞反应，cGMP及信号传递。 第五章 质膜磷脂代谢产物胞内信使及其信号转导 质膜磷脂代谢及其胞内信使的发现，肌醇磷脂信使途径的模型，肌醇磷脂代谢信号 分子的产生与灭活，IP3/Ca2+和DG/PKC信号传递途径，PI-3K信号转导途径。 第六章 胞内钙信号途径 钙信号的发现，钙信号的产生及上游调控因子，钙信号的终止，钙信号的时空多样 性，钙结合蛋白，钙.钙调素依赖的蛋白质磷酸化，钙与钙调素信号系统的细胞功能。
磷脂酰肌醇3激酶途径在哮喘大鼠气 磷脂酰肌醇 激酶途径在哮喘大鼠气 道平滑肌细胞增殖中的作用
• 【摘要】 目的 ：观察哮喘大鼠肺组织中p-Akt、p-p70S6K含量变化， 探讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号转导途径在哮喘大鼠气道平滑肌 细胞（ASMC）增殖中的作用。方法 ：SPF级健康雄性SD大鼠36只， 随机分为对照组（C组）、哮喘组（A组）和wortmannin干预组（W 组），每组12只。以卵蛋白（OVA）致敏和激发的方法制备大鼠慢性 哮喘模型。观察各组大鼠气道炎症和细胞浸润情况；以图像分析软件 测定气道壁厚度（Wat）及气道平滑肌层厚度（Wam）；以Western blot法检测肺组织p-Akt及p-p70S6K表达情况。结果：①A组大鼠Wat、 Wam大于C组（P <0.01）；W组大鼠Wat、Wam小于A组（P <0.01），大于C组（P <0.01）。②A组p-Akt及p-p70S6K含量均高于 C组（P <0.01）；W组低于A组（P <0.01），但高于C组（P <0.01）。③p-Akt蛋白含量与Wam/Pbm呈显著正相关(r =0.779，P <0.01) ；p-Akt蛋白含量与p-p70S6K蛋白含量呈显著正相关(r =0.803， P <0.01)。结论 ：哮喘大鼠肺组织中PI3K/Akt/p70S6K途径激活，抑 制该途径可减轻哮喘大鼠ASMC增殖。 • 【关键词】 哮喘 大鼠 气道重塑 信号转导 平滑肌细胞
•
哮喘患者的气道重塑主要包括气道平滑肌细胞 (airway smooth muscle cells，ASMC)增生/肥大、 基底膜增厚、血管生成等，其中最明显的是 ASMC的增生和肥大[1]。磷脂酰肌醇3-激酶 （PI3K）在ASMC增殖中的作用最近有初步阐明， 但其是否介导哮喘ASMC增殖尚不明确。我们通 过复制大鼠慢性哮喘模型，研究PI3K的下游信号 分子Akt、p70S6K活性变化，并予PI3K特异性抑 制剂wortmannin干预，探讨PI3K信号途径在哮喘 ASMC增殖中的作用。
细胞信号转导 Cell Signal Transduction
• 课程编号：071009J02 课程属性：专业基础课 学时/学分 课程编号 课程属性 学时 学分 ： 60 / 3 • 教学目的及要求： 教学目的及要求： • 本课程为细胞生物学专业研究生的专业基础课，同时也可作为相关专 业研究生的选修课。 • 细胞信号转导是细胞生物学学科进展最快的研究领域之一，信号转导 的概念已经开始深入到生命科学的各个领域。本课程内容涵盖受体、 G蛋白、环核苷酸第二信使、质膜磷脂代谢产物胞内信使、钙信号途 径、酶活性受体、蛋白质可逆磷酸化及其对基因表达的调控、信号转 导途径的多样性、网络化和专一性等方面的研究现状和进展，还综述 与信号转导相关的疾病和药物研究进展，介绍本领域研究方法、诺贝 尔奖的工作和中国科学家的贡献等。
• • • • • • • • • • • • • • • •
第七章 酶活性的受体与跨胞质信号转导 受体酪氨酸蛋白激酶（RPTK），细胞因子受体超家族，肿瘤坏死因子受体家族，受体丝/苏氨酸蛋 白激酶，受体酪氨酸蛋白磷酸酶（RPTP）。 第八章 蛋白质可逆磷酸化及其对基因表达的调控 真核生物的蛋白激酶，蛋白磷酸酶，蛋白质可逆磷酸化对信号转导的调节方式，蛋白质可逆磷酸 化与基因表达调控，蛋白质可逆磷酸化在细胞信号中的意义。 细胞信号转导途径的多样性、 第九章 细胞信号转导途径的多样性、网络化和专一性 细胞信号转导途径的多样性，细胞信号转导途径之间的网络化，细胞信号网络系统中专一性形 成的分子基础。 第十章 细胞信号转导与疾病 由于信号转导过程异常的疾病研究思路，由于信号转导通路中信号分子异常造成的疾病。 第十一章 细胞信号转导与药物 早期工作，重要示例，以信号转导为靶进行疾病治疗的药物，调节信号转导的过程以治疗疾病，分 子水平上药物新靶点的研究，分子生物学及基因克隆技术的应用，最新技术的应用。 第十二章 细胞信号转导研究方法 具体实例，新技术。 第十三章 中国科学家的研究贡献 中国海外科学家的贡献，中国本土科学家的研究概况。 第十四章 细胞信号转导研究与诺贝尔奖 前期获奖成果，1990年后获奖成果，预计获奖成果，启示。
• • • •
•
2.3 各组大鼠肺组织p-Akt蛋白和p-p70S6k蛋白表达情况 A组大鼠肺组织p-Akt表达量较C组升高， W组p-Akt蛋白表达量较A组降低，但仍高于C组（见表2、图2）。A组大鼠p-p70S6K表达量较C组 升高，W组p-p70S6K蛋白表达量较A组降低，但仍高于C组（见表2、图3）。 2.4 相关性分析 Wam/Pbm与p-Akt蛋白含量呈显著正相关(r =0.779，P <0.01，n =18)；p-Akt 蛋白含量与p-p70S6K蛋白含量呈显著正相关(r =0.803，P <0.01，n =18)。 3 讨论 气道重塑是慢性哮喘的重要特征，ASMC增殖在哮喘气道重塑中发挥了重要作用。研究发现哮 喘患者气道平滑肌层明显增厚，致死性和非致死性哮喘患者气道平滑肌面积分别增加50%～230% 和25%～150%[6]。本实验观察到哮喘组大鼠气管壁及支气管平滑肌层增厚，且测量的平滑肌厚度 较对照组显著增加，表明在大鼠哮喘气道重塑模型ASMC增殖明显，与以往的报道相一致[7]。 ERK和PI3K的激活可能是介导生长因子、炎症递质和和细胞因子诱导ASMC增殖的两条主要 信号转导途径。Scott等[8]首先发现，PI3K的活性与牛气道平滑肌细胞的丝裂原刺激反应有关， PI3K抑制剂wortmannin可以减少DNA的合成。Krymskaya 等[9]通过显微注射的方法把活化的PI3K 导入ASMC 内，结果证明活化的PI3K能单独刺激ASMC DNA的合成。因此PI3K调节DNA合成并不 依赖ERK，而是一条与之平行的途径。PI3K是细胞内重要的信号转导分子，共分为三型，其中Ⅰ型 中的IA类是由p110（α，-β或-δ）和p85α或p85β或p55γ组成的异源二聚体，广泛表达于哺乳动物的 肺、心、脑组织中，主要为受体或非受体型酪氨酸蛋白激酶激活。PI3K活化后可催化磷脂酰肌醇在 D3位的磷酸化，把底物PtdIns(4，5)P2转化为PtdIns(3，4，5)P3，作为第二信使激活下游信号分 子如Akt、p70S6K调解细胞周期蛋白表达，进而磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），促进DNA的 合成，推进细胞增殖周期的进展，从而调节ASMC的增殖[10]。