FVIII抗体检测二、实验室诊断（一）初筛试验凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）正常，活化部分凝血活酶时间（APTT）延长。

（二）纠正试验（证实有时间依赖性的抑制物存在）延长的APTT不能被正常混合血浆纠正。

多数血友病患者替代治疗后产生抑制物显示特征性模式，即患者血浆与正常混合血浆按1:1比例混合后的即刻APTT 结果介于两种分别检测的APTT结果之间，但当37℃混合温育1-2小时后检测APTT，其APTT结果进一步延长。

（三）确诊试验FⅧ:C减少，且随孵育时间呈进行性下降。

（四）抑制物定量测定（Bethesda方法；Nijmegen改良法）1. Bethesda法（1975年，Kasper）（1）试验原理：血友病A患者产生的FⅧ抑制物呈时间依赖性。

在含抑制物的血浆中加入人源或猪源FⅧ，37℃混合温育，随孵育时间延长，FⅧ被抑制物逐渐中和。

如加入FⅧ的量和孵育时间标准化，则可根据FⅧ被中和的量，以Bethesda 单位的方式确定抑制物滴度。

（2）检测方法：将患者血浆与正常混合血浆按一定比例混合，37℃温育2小时后，测定该混合物中剩余的FⅧ :C水平。

1BU的定义：能使血浆中FⅧ:C 降低50%的抑制物活性为1个Bethesda单位（BU）。

患者血浆稀释倍数的倒数为患者血浆抗体滴度的BU值。

（图1）图1. 抑制物检测（Bethesda法）（3）操作步骤1）将患者血浆用OVB缓冲液按一定比例倍比稀释，一般做多个稀释倍数，样本一直置于冰上保存。

如果之前有关于抑制物检测的相关资料，则可作为参照对样本进行适当的稀释。

2）将正常混合血浆（FⅧ浓度已经过标准化检测）等量加入每份待测的稀释血浆样本中，FⅧ浓度通常为100 IU/dl。

因此，每份混合物的FⅧ起始浓度大约为50 IU/dl。

3）37℃孵育2小时后进行FⅧ:C检测，采用正常混合血浆和乏FⅧ血浆的混合物作为标准品进行定标，并以该标准曲线来计算其它混合物的FⅧ活性。

本检测中，此混合物的FⅧ:C为100%。

4）根据残余FⅧ与抑制物单位的关系图计算抑制物的浓度。

（4）结果解释：Bethesda试验结果解释见表1。

表1. Bethesda试验的结果解释滴度（BU/ml）结果解释＜0.5 不显著0.5~5 存在低浓度抑制物：——可以被过量的FⅧ纠正——可能是低反应型＞5 存在高浓度抑制物：——FⅧ不起作用——免疫记忆反应，产生更多抑制物（高反应型）2. Nijmegen改良法（NA）（1）试验原理：在正常混合血浆中加入0.1mol/L、pH7.4咪唑缓冲液。

由于使用了缓冲体系，使反应中pH值更加稳定，提高试验准确性与敏感性，适合低滴度抗体的检测，受到世界血友病联盟（World Federation of Hemophilia，WFH）的推荐。

（2）试验方法：将患者血浆与缓冲后的正常混合血浆于37℃共同温育2小时，以保证体系pH稳定。

以正常混合血浆与乏FⅧ血浆组成的对照混合物（和患者血浆混合物在同样条件下温育）为标准品制备标准曲线，其余样本按照该标准曲线检测残余FⅧ水平。

采用假定100%残余FⅧ= 0BU/ml，50%残余FⅧ= 1BU/ml （国际上认可的抑制物活性转换方式）而建立的残余FⅧ和抑制物之间的相互转换的双对数曲线，将残余FⅧ转换为抑制物单位。

当残余FⅧ活性＜25%，必须稀释后重新检测患者血浆，以免低估抑制物的滴度。

规定抑制物滴度≥0.6BU/ml 为阳性（具有显著性临床意义）。

（3）操作步骤：使用咪唑缓冲液作为稀释液，将患者血浆进行倍比稀释，建议从原倍开始，1/2、 1/4、以此类推，每管总体积为0.2 ml。

如果患者之前接受过抑制物检测，其检测结果可作为稀释度的大致指南。

如果患者最近接受过FⅧ治疗，则抑制物水平有可能偏高或偏低。

其余步骤同Bethasda方法。

（4）结果解释：应选择残余FⅧ含量接近50%的稀释度，但也可选择残余F Ⅷ在30%~60%范围内的待测血浆稀释倍数用于抑制物的计算，只需计算每份稀释度的结果，取平均值即可。

根据抑制物单位的定义，以残余FⅧ%-抑制物单位在双对数曲线上绘制标准曲线。

读取每份待测混合样本中残余FⅧ相对的抑制物水平，并以稀释倍数进行校正。

例如：（1/4 稀释 + 正常混合血浆）残余FⅧ= 50%，抑制物单位（根据图表）= 1 BU，乘以稀释倍数（4倍稀释）= 4BU抑制物的诊断通常要以至少2次抑制物滴度阳性为准，包括患者过去对治疗的反应及平时的药代动力学（pharmacokinetics，PK）研究。

（五）抑制物的分类（高滴度；低滴度；高反应；低反应）2001年国际血栓与止血学会规定高滴度抑制物＞5BU；低滴度抑制物≤5BU。

高反应型：输注FⅧ后抑制物滴度升高5BU以上；低反应型：输注FⅧ后抑制物滴度仍小于5BU。

（六）血友病B伴FⅨ抑制物FⅨ抑制物是体内产生的特异性抑制或灭活FⅨ促凝活性，引起FⅨ水平降低的抗FⅨ抗体，包括：血友病B患者输注FⅨ制品替代治疗后产生灭活FⅨ活性的同种异体抗体；非血友病B患者自发产生的自身免疫性抗FⅨ抗体引起出血并发症（亦称获得性血友病B）。

血友病B伴FⅨ抑制物发生率为1%~3%。

与抗FⅧ抗体不同的是抗FⅨ抗体在体外活性为即刻免疫反应（超敏反应），不依赖时间与温度。

如果反复、大剂量输注FⅨ可产生肾病综合征（如免疫耐受诱导治疗）。

实验室检查：FⅨ:C减少；FⅨ抑制物呈即刻灭活FⅨ:C特点，不呈时间和温度依赖性。

FⅨ抑制物定量（Bethesda法）测定（同 FⅧ抑制物检测）。

由于抗原/抗体呈快速反应，FⅨ抑制物与FⅧ抑制物显示出不同的酶动力曲线，与FⅨ进行完全且快速的抗原抗体反应。

抗FⅨ IgG在体外的活性为即刻免疫反应，不依赖时间与温度，见表2。

表2 FⅧ抑制物与FⅨ抑制物不同生物学特点FⅧ抑制物FⅨ抑制物IgG：IgG4 亚型无免疫复合物病某些FⅧ抗体具有蛋白水解特性IgG：IgG4为主45% FⅨ过敏反应反复、大量输注FⅨ可发生肾病综合征体外活性：依赖温度与时间体外活性：即刻（非温度与时间依赖）检测同Bethesda方法（无需孵育）方法：患者血浆中加入等量外源性FIX（正常混合血浆），37℃孵育10分钟后进行FⅨ:C检测。

1个单位FⅨ抑制物的定义为：在37℃条件下，10 分钟内灭活50%FⅨ活性的抑制物的量。

凝血因子Ⅺ、Ⅻ、Ⅴ、Ⅹ、Ⅱ、Ⅶ、Fg抑制物罕见，其诊断可参照FⅧ抑制物检测，故本章不再赘述。

三、检测方法的特性（一）抑制物检测的误区和局限性1. 抑制物检测的误区（1）当残余FⅧ活性＜25%时，易低估抑制物的滴度，必须稀释后重新检测患者血浆。

（2）如患者最近接受过FⅧ治疗，则抑制物水平有可能偏高或偏低。

（3）残余FⅧ＜25%或＞75% 的其他任何稀释度均不得用于计算抑制物的含量。

（4）重型血友病A患者进行抑制物定量检测时，其样本FⅧ含量很低或不能测出。

如待测血浆中含有5 IU/dl以上的FⅧ，则在计算抑制物滴度时必须予以考虑。

可采用如下三种方法：方法1：在对照混合样本中加入比待测混合样本更多的因子，以补偿待测混合样本中的FⅧ。

如待测血浆中含20 IU/dl FⅧ，则对照混合样本则由120μl正常混合血浆和80μl乏FⅧ血浆制成（在孵育开始时，待测和对照混合样本中均含有大约60 IU/dl的FⅧ）。

方法2：分析前于58℃将待测血浆加热灭活90分钟，破坏所有凝血因子，包括FⅧ。

由于免疫球蛋白具有耐热性，因此，抑制物的滴度不受这种处理方式的影响。

方法3：在对照混合样本中使用的乏FⅧ血浆非常重要。

应包含正常水平的vWF，已证实如果乏FⅧ血浆不含vWF，则抑制物滴度可降低30%~50%。

2. 抑制物检测的局限性（1）一期法检测局限性1）如果存在狼疮抗凝物则有干扰。

2）一期法检测的正常FⅧ:C结果不能排除轻度血友病A。

20%以上的轻度血友病A患者与此差异相关，表明不同检测系统所得结果存在着两倍差异。

一期法的结果往往比二期法或发色底物法的结果高两倍，甚至5倍。

少数患者一期法结果在正常值范围内，但二期法或发色底物法结果降低。

这些患者临床出血表型与二期法或发色底物法测得的低FⅧ:C一致。

约5%-10% 轻度血友病A患者一期法FⅧ:C正常，但基因分析确认为轻型血友病A，需采用二期法或发色底物法检测，即使APTT和一期法检测结果正常。

有些轻型血友病A一期法检测FⅧ:C下降，但是二期法或发色底物法测得结果正常，没有个人或家族出血病史，也无需 FⅧ:C替代治疗，其临床表型与发色底物法或二期法检测FⅧ:C一致。

经基因确认为轻度血友病 A 患者。

检测结果差异见表3。

表3 基因确认为轻度血友病 A 患者检测结果差异病例一期法（IU/dl）二期法（IU/dl）发色底物法（IU/dl）A 101 34 13B 88 15 28C 63 30 40D 55 24 40E 58 21 33F 72 21 36G 84 19 45（2） Bethesda方法（BA）的局限性1）非特异性假阳性高达32%，假阴性5%。

改良的Nijmegen方法（NA）通过缓冲正常混合血浆（buffered normal pool plasma，BNPP）和乏FⅧ血浆代替咪唑缓冲液作为参照样品提高敏感性和特异性。

此外建议：试验中加热去除剩余FⅧ、选用标准的FⅧ参照血浆、应用4 mol/L咪唑溶液以及剩余FⅧ与发色底物的作用，可进一步提高该方法的敏感性及特异性。

2）变异性大—室间质量评估（EQA）各种EQA团队证实实验室内部变异系数（CV）高达（有时超过）50%。

变异性大是由于检测变异性可发生在检测的任何阶段，包括检测试剂的选择和来源、缓冲液、BNPP等，即使相同的流程，也难以得到RCPA EQA程序中两个相同的参数。

虽然NA的变异性比BA低，但不同实验室NA的变异性同BA一样仍然很高。

实验室内部差异可统一试验方法和试剂，通过试验方法的标准化可以得到可接受的实验室内部变异。

3. 检测结果的偏差可发生在诊断过程中的任何阶段，包括分析前阶段（医师检测、标本收集），分析阶段，分析后阶段（实验结果解释和报告、医师的解释和处理）。

（1）分析前阶段：检查检测步骤的准确性及相关性（以确保检测正确实施）；核对和注意血液标本（准确的抗凝剂，适当填充等）；可避免误差及假阳性或阴性结果。

（2）分析阶段：了解检测的局限性如低抑制物敏感度；采用最优方法及已经验证的改良法（有助于保证准确性）；进行适当的内部质量控制并参与EQA（以确保准确性）；必要时重复检测（确保准确性，避免假阴性或假阳性）；（3）分析后阶段：当检验结果与预期值不匹配时用新样本重复检测；向临床医生提供咨询以协助检测结果的解释。

4. 抑制物检测的敏感性和特异性有待进一步提高BA和NA均对低抑制物活性缺乏敏感性。