大规模可溶性蛋白纯化实验操作
Hao Lab in SII
1. 取20 µL E.coli BL21目的菌种加入装有10 ml LB培养基的50 ml离心管中，加入氨苄青霉素(Biobasic inc, #AB0028) 至终浓度为100 µg/ml或硫酸卡那霉素(生工，#0408) 至终浓度为50 µg/ml，37°C, 250 rpm, 摇菌过夜。

2. 取过夜培养的菌液8 ml加入400 ml (1:50) 含有相同浓度抗生素的LB中培养，间断检测菌液OD600值，37°C, 250 rpm, 摇菌大约60~120 min，待其OD600值达到0.6~0.8之间，加入0.4 mM IPTG (碧云天，#ST098), 30°C, 220 rpm, 诱导表达3 h。

3. 收集菌液至50 ml离心管中，7,000 × g, 4°C离心3 min, 弃上清收集沉淀，进行下步实验或置于-80°C冰箱保存。

摇菌用的锥形瓶用84消毒液浸泡或高压灭菌。

4. 将收集到的菌体重悬于20 ml 冰冷的Lysis buffer中，震荡混匀。

以下步骤均置于冰上。

5. 向菌体重悬液加入甘油至终浓度为10%，加入EDTA 至终浓度为0.5 mM，充分混匀。

6. 冰上超声：功率为仪器最大功率的60%，脉冲时间为1 s，间隔时间为1 s，总时间7~15 min。

7. 超声后的蛋白溶液于8,000 × g，4°C离心30 min。

15,000 × g, 4°C离心15 min可省略步骤10。

8. 在步骤7离心的同时。

取下20 ml新层析柱(Qiagen, #34964)的帽子并剪掉底部尖端再盖上帽子，加入混匀的50% NI-NTA beads (Qiagen, #S13-26-36-46; GST beads, GE, #17-0756-01) 悬液2 ml。

9. 取下层析柱的帽子使NI-NTA beads重悬液体流净再盖上帽子，加入PBS至总体积约20 ml，用5 ml 移液器轻柔吹打混匀(避免气泡产生)，静置5 min之后取下层析柱的帽子将液体放空并盖上帽子，重复二次。

10. 取步骤7，离心后的上清用0.45 µm滤器(Millipore, #SLGP033RS) 过滤，滤液置于50 ml离心管中。

11. 取适量蛋白溶液将NI-NTA beads重悬并转移到装有蛋白溶液的50 ml离心管中。

4°C摇荡过夜。

空的层析柱加入约10 ml PBS，4°C保存。

12. 将摇荡过夜的beads和蛋白混合液以50 × g, 4°C离心1 min使beads沉淀。

保留上清于4°C冰箱，可以考虑用旧的beads做二次结合。

13. 用10 ml PBS重悬beads, 50 × g, 4°C离心1 min, 弃上清，重复一次。

再以20 ml wash buffer 重悬，装入层析柱中，静置5 min, 取下层析柱的帽子，收集0.5 ml流出的液体并保存于2ml离心管中待检测，标记为20W-1，剩余液体流空再盖上帽子。

14. 用20 ml wash buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子，流空液体，盖上帽子。

15. 用20 ml wash buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子收集0.5ml流出的液体并保存于2ml离心管中待检测，标记为20W-3，剩余液体液体流空，盖上帽子。

16. 加入5 ml Elution buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子，收集液体，于15 ml新离心管中并留样品20 µl, 标记为E-1。

为盖上帽子。

用Nanodrop2000粗测蛋白浓度。

再以3 ml Elution buffer 重复三次上述步骤，收集至另一新15 ml离心管中。

17. 回收beads: 洗脱后的NI-NTA beads以20 ml PBS重悬，静置5 min，取下层析柱的帽子，流空液体，盖上帽子。

再以20 ml PBS重复两次上述步骤。

再用20 ml 0.5 M NaOH重复一次，加入约10 ml 30%乙醇置于4°C保存。

19. 将16步得到的蛋白溶液加入3 KDa的15 ml超滤管(Millpore, #UFC900396)中, 4,000 × g, 4°C离心45 min进行超滤。

倒掉超滤管底的废液，将约为15 ml PBS加入超滤管中，轻轻颠倒混匀，4,000 ×g, 4°C离心45 min，倒掉超滤管底的废液。

重复超滤四次，最后一次离心1 h。

如果16步第一次收集的蛋白溶液粗测浓度大于0.5 mg/ml，可以先超滤第一次洗脱得到的5ml蛋白溶液，其它的再用同一个超滤管进行第二次超滤。

纯化后的蛋白溶液留样20 µl标为EC，加入终浓度为40%的甘油，每管100 µl分装，-80°C保存。

SDS-PAGE检测各样品的蛋白浓度及纯度。

溶液配制：
0.5 M EDTA stock, pH8.0: 93.05 g Na2EDTA•2H2O 加入350 mL ddH2O。

10M NaOH调整pH 至8.0 with (约25 mL，缓慢加入)。

加ddH2O至500 ml。

高压灭菌，室温保存。

10 M NaOH: NaOH 16g，加ddH2O至40 ml, 0.22 µM滤器过滤除菌。

Wash buffer：20 mM imidazole/PBS
Elution buffer: 300 mM imidazole/PBS
甘油储存液：80%甘油/ PBS，高压灭菌。

Lysis buffer: 1% Triton-X100/PBS。

(Triton-X100储存液：20%用PBS配制)
1 M IPTG (异丙基硫代-β-D半乳糖苷): 在8ml ddH2O中溶解2.383g IPTG后，用ddH2O定容至10ml, 0.2
2 μm滤器过滤除菌，分装成1 ml -20°C避光保存。

3 M Imidazole (生工，#IB0529): 2.0
4 g 加入PBS至10 ml, 0.22 µM滤器过滤，4°C保存。