选修3模块易误解的知识点整理：从化市第六中学詹金镇1.基因工程中工具与工具酶基因工程中的工具包括限制酶、DNA连接酶和载体，而工具酶不包括载体，只有限制酶和DNA连接酶。
2.限制酶（摘自：《生物学通报》2013年3期作者：陈卫东）关于限制酶的特异性，常会有以下几个疑问：（1）一种限制酶只能识别一种碱基序列吗？一种限制酶通常只识别一种特定的碱基序列，但是有少数限制酶却可以识别不止一种碱基序列。
如：AccⅠ识别的序列是—GT↓MKAC—（其中M代表A或C，K代表G或T），也就是说可识别4种序列（即—GTATAC—、—GTAGAC—、—GTCTAC—、—GTCGAC—）。
HindⅡ能够识别的序列是—GTY↓RAC—（其中Y代表C或T，R代表A或G），也可以识别多种碱基序列。
因此，并不是所有的限制酶都只能识别一种特定的碱基序列。
（2）不同限制酶识别的碱基序列都不同吗？（或一种特定的碱基序列只能被一种限制酶识别吗？）已知发现的限制酶种类要远超过能够识别的碱基序列，这是因为在很多情况下不同限制酶可以识别同一碱基序列，即存在“同裂酶”（或“同切点酶”、“异源同工酶”）。
虽然不同酶识别的碱基序列相同，但它们的切割位点可能不同。
常见的有以下两种情况：①同序同切酶：不同的限制酶识别的碱基序列和切割位置都相同，如Hin dⅡ与Hin c Ⅱ均识别切割位点—GTY↓RAC—，HpaⅡ与HapⅡ均识别切割位点—C↓CGG—，MobⅠ与Sau3AⅠ均识别切割位点—↓GATC—，AhaⅢ与DraⅠ均识别切割位点—TTT↓AAA—。
②同序异切酶：这些酶识别序列虽然相同，但切割位置不同，如KpnⅠ和Asp718Ⅰ识别的序列是相同的，均为—GGTACC—，但它们的切割位点不同，KpnⅠ切割的位点为—GGTAC↓C—，Asp718Ⅰ切割的位点则为—G↓GTACC—。
（3）不同限制酶切出的末端都不能相互连接吗？因不同限制酶切出的末端往往不同，所以会有此疑问。
对于这个问题，我们也可以分为几种情况进行讨论分析：①如切出的末端是黏性末端：同序同切酶：虽然限制酶不同，但识别的碱基序列相同，且切点也相同，它们切出的末端是可以相互连接的。
同尾酶：来源不同，识别的碱基序列也不相同，但能切割产生相同末端的限制酶叫同尾酶。
所有平末端酶产生的末端均是相同的，但一般不把它作为同尾酶来研究。
因此同尾酶一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。
同尾酶中，识别序列不同的限制酶，虽然识别的碱基序列不同，但是切开的黏性末端的碱基却能够正好相互配对，在DNA连接酶的作用下能形成重组DNA分子，如：限制酶Bam HⅠ识别的碱基序列为—G↓GATCC—，限制酶BglⅡ识别的碱基序列为—A ↓GATCT—，限制酶MboⅠ识别的碱基序列为—↓GATC—，限制酶BamHⅠ切开的DNA两条链的黏性末端中没有被配对的碱基是GATC—，限制酶BglⅡ和限制酶MboⅠ切开的黏性末端未配对的碱基也都是GATC—。
通过比较不难发现这三种限制酶切得的黏性末端是可以相互配对连接的。
类似的情况还有不少，如限制酶SalⅠ与XhoⅠ，HpaⅡ与TaqⅠ等。
②平末端：平末端与黏性末端不同，由于不存在类似于黏性末端碱基互补配对的问题，因此不同的限制酶切开的平末端在DNA连接酶的作用下可以相互连接，形成重组DNA 序列。
（4）不同限制酶切开的末端如能重新连接，原有的限制酶是否还能再特异性识别并切开？对于这个问题，还是应该分为几种情况去讨论：①同序同切酶：虽然限制酶不同，但识别的碱基序列相同，且切点也相同，因此它们切出的末端重新连接后，又恢复到原有的碱基序列，这些序列还可以被这些同序同切酶再识别。
②同尾酶：同尾酶识别的靶序列不相同，但能切割产生相同的黏性末端，因此也可以通过碱基互补配对的形式重组。
同尾酶重组后碱基序列与原有两种酶识别的碱基序列均不同，因此原有的限制酶均不再能够识别这种序列，也就不再能够重新切开。
如Bam H Ⅰ识别的序列是—G↓GATCC—，BglⅡ识别的序列是—A↓GATCT—，而Bam HⅠ与BglⅡ切开后的片段重新连接（非自身连接）后的碱基序列是一条链是—AGATCC—，另一条链则为—GGATCT—，已经不是“回文”序列，无论是Bam HⅠ还是BglⅡ都无法再识别，所以无法再把其切开。
③平末端：同样道理，如两种限制酶切开的都是平末端，而这两种限制酶不是同序同切酶，则两种末端虽然可以重组连接，但连接后的碱基序列与原有限制酶识别的序列不同，原有的限制酶也不再能够识别。
3.原核生物中的限制性内切酶有何作用？它为什么不剪切自身DNA？生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
原核生物中，限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，它们具有相同的底物专一性，具有识别相同碱基序列能力。
甲基化酶的甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸，甲基受体为DNA上的腺嘌呤与胞嘧啶。
当限制酶作用位点上的某一些碱基被甲基化修饰后，限制酶就不能再降解这种DNA了，所以限制性内切酶只降解外源入侵的异种DNA，而不分解自身DNA，在消解外源DNA遗传干扰的同时又保护了自身遗传特性的稳定。
4.DNA聚合酶和DNA连接酶（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。
因此DNA 连接酶不需要模板。
5.用PCR技术获得目的基因与从基因文库中获得目的基因的差别构建的文库,实际上是一组微生物构成的整体,构建文库时,先提取DNA,打成小片段(超声波或限制酶水解),和载体结合,再转到受体生物中。
构建文库的工作量是非常大的，尤其是基因组文库，为了确保包含全部基因，需要培养万个以上的受体微生物。
如果已知序列详情，用PCR法获得基因（根据序列设计引物），相比较而言简单快捷多了。
既然简单，那为什么还有构建文库的方法？第一，很多基因不知道序列详情，第二，PCR扩增的长度有限，一般超过1500bp就很困难了，很多基因比这个大多了，所以大的基因还要用构建文库法，所以才有教师用书的补充材料。
【教师用书的补充材料】构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。
如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA 中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。
但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
6.启动子与终止子、起始密码子与终止密码子的区别。
（1）启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。
启动子是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。
（2）起始密码子和终止密码子都是mRNA上三个相邻碱基。
起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。
7.转基因生物与原来生物是不是同一物种？在转基因技术中，所转移的只是自然界中已存在的外源基因，它不会改变生物原有的分类地位，只能说是具有某种新特征的同一物种。
即没有生殖隔离。
8.原代培养和传代培养的概念（摘自：人民教育出版社生物室包春莹）从机体上获取的组织，通过酶或机械方法分散成单个细胞进行培养，在首次传代前的培养一般称为原代培养。
原代培养的最大优点是：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。
原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养，也就是将细胞按1:2～1:4的比例传代。
但严格说来，不论在进行传代时稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养。
传代代数与细胞的世代（增殖代数）并不是同一个概念。
在细胞培养时，所说的“第10代细胞”，仅指该细胞已经传代10次；细胞传一代后，一般能倍增3～6次，经过三个阶段，即潜伏期、指数生长期和平台期。
当细胞达到平台期时，就需要进行传代培养，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至死亡。
9.CO2培养箱细胞培养中所用的培养箱一般称为CO2培养箱，它的气体环境是95%的空气和5%的CO2。
如果气体环境改为95%氧气和5%的CO2，行不行？显然是不行的。
氧气是一种氧化剂，浓度太高，会损伤细胞的。
在有些细胞培养中，还需要加入抗氧化剂如巯基乙醇等。
10.细胞系和细胞株（摘自：人民教育出版社生物室包春莹）细胞系和细胞株，两者曾一度混用，导致有些文献中概念不清。
下面所指的概念是现在国内外比较通用的，也是绝大多数研究者接受的观点。
原代培养物经首次传代成功即称为细胞系（Cell Line），因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞。
其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。
大多数二倍体细胞为有限细胞系。
通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株（Cell Strain），也就是说，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。
细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。
11.为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？就目前来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能达100%。
仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。
更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。
目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。
我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。
我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞(含B淋巴细胞)和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
12．制备单克隆抗体的四次培养和两次筛选（1）四次培养（如下图）：（2）两次筛选：第一次筛选：由于细胞融合是随机的,因此细胞混合物中融合细胞将以多种形式出现,因此必须从中筛选出即能分泌抗体同时又能大量增殖的杂交瘤细胞。