实验一：壳聚糖制备工艺一、实验目的1、了解制备甲壳质和壳聚糖的意义；2、学习甲壳质和壳聚糖制备工艺。
二、实验原理壳聚糖是碱性多糖，有止酸、消炎作用，可抑制胃溃疡。
动物实验表明，可降低胆固醇、血脂。
国外已报道用作心血管系统降低胆固醇的药物。
经分子修饰制得的肝素类似物，具有抗血栓作用，能与肝素妣美。
壳聚糖广泛用于食品与医药，如用作药物的载体具有缓释、持效的优点；用于制作人造皮肤、人造血管、人工肾、手术缝合线等。
虾蟹壳含无机盐碳酸钙和磷酸盐约占45%；蛋白和脂肪约占27%；甲壳质约占20-25%（蟹壳含甲壳质17.1-18.2%;龙虾含甲壳质22.5%;虾壳含甲壳质20-25%）甲壳质是聚-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖，以β-（1，4）糖苷键连接而成，是一种线型高分子多糖，天然的中性粘多糖。
甲壳质一般与蛋白质或碳酸钙或两者紧密结合在一起。
盐酸浸泡处理可除掉壳里的无机盐碳酸钙、磷酸盐，壳中的CaCO3与HCL生成CaCL存在于废酸液中被除掉。
碱处理可除掉壳中的蛋白和脂肪。
经分离制得的甲壳质为白色无定型粉末，或亮白色半透明的小片状物。
甲壳质不溶于水、稀酸、碱溶液和乙醇、乙醚等有机溶剂，溶于无水甲酸、浓无机酸。
浓热碱液与甲壳质作用，可脱掉甲壳质分子结构上的乙酰基，生成壳聚糖。
即壳聚糖是由甲壳质在高浓度碱液中脱乙酰制备而成。
壳聚糖为可溶性甲壳质，化学名称为聚-2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖，以β-（1，4）糖苷键连接而成。
相对分子量约为12万-59万，是一种大分子阳离子聚合物。
壳聚糖不溶于水和一般有机溶剂，不溶于碱，可溶于酸性水溶液（但不溶于硫酸）。
制备高黏度（高分子量）壳聚糖，脱乙酰工艺路线有几条，学生自行设计：1.60-70℃，40-41%NaOH溶液保温20h；2.110-120℃，45-50% NaOH溶液反应1h左右；3.间歇式工艺路线：100℃条件下，45%的NaOH 溶液，1+1间歇反应2次，每次反应1h，每次反应后水洗至中性。
三、实验材料1.材料与试剂虾壳，1mol/L盐酸，5%氢氧化钠，95%乙醇，乙醚，硼氢化钠2.仪器与设备粉碎机，20目筛，方盘，磁力搅拌器，电磁炉，恒温水浴锅，真空干燥箱，布氏漏斗，抽滤瓶，循环水泵，三口烧瓶，冷凝管，温度计，烧杯，量筒，pH试纸，滤纸，纱布。
四、实验步骤虾壳（称重，取25g），加1mol/L盐酸溶液，（固液比1:10，搅拌，静置12h）过滤。
加5% 氢氧化钠溶液，（固液比1:8），搅拌,隔水煮1h，过滤，得甲壳质，烘干，粉碎，待用。
取5g甲壳质于三口瓶中，加45%氢氧化钠溶液（固液比1:20），再加1% 硼氢化钠，于110-120℃搅拌反应1h，冷却，离心，移去上清液，水洗沉淀，再离心，再移去上清液，水洗沉淀，再移去上清液，以95%乙醇洗涤沉淀，一起倒入抽滤瓶中，抽滤，留滤饼，得壳聚糖，晾干，称重。
五、实验结果1.测定产品的主要质量指标黏度和脱乙酰度；2.每种指标有两种测定方法，学生可以自选，测定方法见实验讲义附件。
六、思考题1．由甲壳质制备壳聚糖为什么要加入硼氢化钠？2．如何评价壳聚糖的质量？七、参考书目李良铸、李明晔编〈最新生化药物制备技术〉中国医药科技出版社，2001.3附：壳聚糖脱乙酰度测定方法壳聚糖的脱乙酰度，也就是壳聚糖分子链上自由氨基的含量，是一项极为重要的技术指标之一。
壳聚糖脱乙酰度的高低，直接关系到它在稀酸中的溶解能力、黏度、离子交换能力、絮凝性能和氨基有关的化学反应能力，以及许多方面的应用。
壳聚糖的脱乙酰度可定义为壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总的糖残基数的百分数。
测定脱乙酰度的方法有很多，如：红外光谱法、紫外光谱法、滴定法等。
方法一：紫外光谱法仪器：紫外-可见分光光度计、紫外皿4个、精密pH计1台100mL容量瓶3个、电子天平1台、架1个、10mL试管15支500mL烧杯1个、250mL烧杯1个、50mL烧杯1个试剂：N-乙酰葡萄糖胺、去离子水、盐酸（分析纯）方法：以0.001mol/L HCl (分析纯) 为溶剂，用0.1mg/mL N-乙酰葡萄糖胺标准品配成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL 的标准溶液。
以0.001mol/L HCl为参比液，在199nm处测定系列溶液的吸光度，最大吸光度A与浓度C的关系为A=17C.称10~20mg壳聚糖样品于100mL容量瓶中，加入10mL 0.01mol/L盐酸，全部溶解后，用去离子水稀释至刻度、摇匀。
以0.001mol/L盐酸作参比液，测量其在199nm时的吸光度，制作工作曲线，从工作曲线中得到样品中N-乙酰葡萄糖胺的浓度，从而求得脱乙酰度（%）=100%-（样品中乙酰基浓度/标准品浓度）×100%。
方法二：酸碱滴定法酸碱滴定法，不需要特殊的仪器，重复性较好，特别适合于生产过程中的质量监控。
仪器：碱式滴定管2个、500mL烧杯1个、250mL烧杯2个50mL烧杯1个、吸管2个、滴定台1个250mL三角瓶9个、精密pH计1台、100mL容量瓶3个电子天平1台、试管架1台、10mL试管10支试剂：N-乙酰葡萄糖胺，凡士林，去离子水，盐酸（分析纯），甲基橙指示剂，氢氧化钠滴定液（0.1mol/L），盐酸滴定液(0.1mol/L)。
①实验原理：壳聚糖的自由氨基呈碱性，可与酸定量地发生质子化反应，形成壳聚糖的胶体溶液，溶液中游离的H+用碱反滴定，这样，从用于溶解壳聚糖的酸量与滴定用去的碱量之差，即可推算出壳聚糖自由氨基结合酸的量，从而计算出壳聚糖分子中自由氨基的含量。
②实验前准备：用1mol/L的盐酸标定NaOH，得C NaOH=0.1047mol/L根据药典的规定配制甲基橙指示剂；③实验步骤：准确称取0.3～0.5克壳聚糖样品，置于250mL三角瓶中，加入标准0.1mol/L 盐酸溶液30mL，在20～25℃搅拌至溶解完全（可加适量的蒸馏水稀释），加入2～3滴指示剂，用标准0.1047mol/L的NaOH溶液滴定游离的盐酸。
另取一份样品，置于105℃烘干至衡重，测定水分。
每个样品要各测3次。
④计算：DD％＝{[(C1V1-C2V2)×0.016]/[G(100-W)×0.0994]}×100％其中：C1——盐酸标准溶液的浓度，mol/LC2——氢氧化钠标准溶液的浓度,mol/LV1—加入的盐酸标准溶液的体积，mLV2—滴定耗用的氢氧化钠标准溶液的体积，mLG—样品重，gW—样品的水分，％；0.016—与1mL，1mol/L盐酸溶液相当的氨基量，g。
注意事项：在室温下溶解样品；样品必须是中性的；样品必须是中性的，否则会影响测定结果。
附：壳聚糖粘度与粘均分子量测定方法黏度反映了高分子物的分子量大小。
壳聚糖是一种天然高分子多糖，分子量大小不同，其物理机械性能也不一样，用途也不同，因此黏度是其一项重要指标。
黏度的测定方法有多种，其物理意义不一样。
在壳聚糖的生产上，常用旋转黏度计和乌氏黏度计来测定壳聚糖的黏度。
测定方法不同，物理意义不一样。
方法一：乌式粘度稀释法乌氏黏度计的原理是在一定温度和溶剂条件下，特性黏度[η]和高聚物摩尔质量M之间的关系通常用带有两个参数的Mark-Houwink经验方程式来表示：[η]=KMα式中，M为黏均摩尔质量；K为比例常数；α是与分子形状有关的经验参数。
K和α值与温度、聚合物、溶剂性质有关，也和分子量大小有关。
K值受温度的影响较明显，而α值主要取决于高分子线团在某温度下，某溶剂中舒展的程度，其数介于0.5～1之间。
K与α的数值可通过绝对方法确定，有下列公式可求[η]y=[η]=式中，t为测定溶液黏度时液面从a刻度流至b刻度的时间；t0为纯溶剂流过的时间，c为壳聚糖溶液的浓度，可以看出高聚物摩尔质量的测定最后归结为特性黏度[η]的测定。
本实验采用毛细管法测定黏度，通过测定一定体积的液体流经一定长度和半径的毛细管所需时间而获得。
仪器：乌式粘度计、秒表1块、100mL量瓶3个、恒温水浴锅1个电子天平1台、移液管2mL 3支、1mL 2支、吸嘴2个大烧杯2个、量筒100mL、量筒10mL试剂：N-乙酰葡萄糖胺、去离子水、盐酸（分析纯）、氯化钠混合溶剂（醋酸0.1mol/L，氯化钠0.2mol/L）方法：1.仪器：乌氏黏度计、恒温水浴一套、秒表、温度计：分度为0.1℃，用于测水浴温度。
2.实验前准备：黏度计的洗涤，先用热洗液(经砂心漏斗过滤)将黏度计浸泡再用自来水、蒸馏水分别冲洗几次，每次都要注意反复流洗毛细管部分，洗好后烘干备用；调节恒温槽温度至(25.0±0.1)；3.操作步骤：把壳聚糖样品干燥衡重，精确称取1～1.2g(称量精度0.005g)，用0.1mol/L 乙酸-0.2mol/L氯化钠溶剂配成50mL样品溶液，此样品溶液的浓度为C1，此溶液经过过滤，精密量取中间部分滤液10mL，移入乌氏黏度计测管（粗管），将黏度计垂直固定于衡温水浴中保温达10分以上，使管内溶液的温度与水浴温度达到平衡。
在另外2根支管口各接1根乳胶管，将侧管上面的乳胶管用夹子夹住，在B管处用洗耳球将溶液从F球经D球、毛细管、E球抽至G球2/3处，松开食指，让C管通大气，此时D球内的溶液即回入F球，使毛细管以上的液体悬空。
毛细管以上的液体下落，当液面流经a刻度时，立即按停表开始记时间，当液面降至b刻度时，再按停表，测得刻度a、b之间的液体流经毛细管所需时间。
重复这一操作至少三次，它们间相差不大于0.3s，取三次的平均值为t1。
4.溶剂流出时间的测定：先用壳聚糖溶液的溶剂润洗黏度计几次，步骤如上, 实验完毕后，黏度计一定要用蒸馏水洗干净。
计算产品粘均分子量精密称取壳聚糖0.3g，置100mL量瓶中，加入混合溶剂（醋酸0.1mol/L，氯化钠0.2mol/L）80mL，加热使溶解，放冷，加混合溶剂至刻度。
按药典法测定特征性粘度【η】，按公式：【η】=1.81×10-3M0.93计算平均得：M=log0.93η/1.81×10-3壳聚糖的粘度与分子量相关，分子量越大，粘度越大。
粘度与壳聚糖药剂学上的某些应用（如膜剂）相关，故设立此项。
用乌氏粘度计稀释法测定。
具体计算为：【η】=【ln（T/To）】/CT：供试液流出时间；To：溶剂流出世间；C：供试液浓度（g/mL）。
【η】代入公式计算。
因药典要求T在120~180s之间，参照一般报道分子量设定=1×106设T=150s【2】，实验测得To=20s，计算得C=0.3%，初配壳聚糖醋酸液的浓度为0.3%，具体浓度应视T值实际情况相应调整。
判断标准（高粘度壳聚糖：1%壳聚糖溶于1%醋酸溶液中，粘度大于1000mPa.s ；中等粘度壳聚糖：1%壳聚糖溶于1%醋酸溶液中，粘度为100~500mPa.s ；低粘度壳聚糖：2%壳聚糖溶于2%醋酸溶液中，粘度为25~50mPa.s）方法二：NDJ-5S数字式粘度计法NDJ-5S数字式粘度计法使用说明NDJ- 系列粘度计是采用高细分驱动步进电机、16 位微电脑处理器和带夜视功能液晶屏的数字显示式粘度计。