Walter Gilbert 1980 Nobel Price
Frederick Sanger 1980 Nobel Price
1975年时，共同发展出一种称为 链终止法（chain termination method）的技术来测定DNA序列， 主要是先进行PCR，利用DNA引 物和DNA聚合酶使DNA链得以展 开复制，再利用双去氧核苷酸 （dideoxynucleotides）来终止 DNA链的合成
染色体与质粒
• • • • • • • • • 存在于染色体外（细菌的DNA除大部分集中于核质内） 双链环形DNA 分子量远比染色体为小，仅为细菌染色体DNA的0.5～3% 质粒亦可携带遗传信息，可决定细菌的一些生物学特性 质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质 质粒的传递（转移）是细菌遗传物质转移的一个重要方式。有些质粒本身 即具有转移装置，如耐药性质粒（R质粒）； 质粒可自行失去或经人工处理而消失。 质粒可以独立复制 可有几种质粒同时共存在于一个细菌内
2）质粒各个元件的识别
3）质粒的分类
1）质粒命名
质粒载体的命名，首字母用小 写p表示，后面是一些描述性 的缩写，如:pBR322的字母代 表研究者F.Bolivar和 R.Rodriguez, 而322是与研究 者设计相关的数字编码。
1. 如何寻找合适的载体/质粒？
1）质粒的命名 2）质粒各个元件的识别**** 3）质粒的分类
细菌质粒（plasmid）
是一种细胞质遗传因子，是细菌细胞内独 立于染色体外的一种复制子，它在细胞分 裂时，能恒定地传给子代细胞，并能给细 胞带来表观效应，但是它的消失并不影响 细胞生存
Herbert W. Boyer
发现细菌的基因可与真核生物 基因结合。用转基因细菌人工 合成了胰岛素，随后在1979 年合成了生长激素。1976年 与罗伯特· 斯旺森建立了基因 泰克公司。1980年获拉斯克 基础医学研究奖，1990年获 国家科学奖章，2004年获邵 逸夫奖。
2) 质粒的各个元件
一个复制子（replicon）
（DNA复制是从一个DNA复制 起点开始，最终由这个起点起始 的复制叉完成的片段。）
几个克隆位点 一个选择性标记
复制子
多克隆酶切位点 (MCS multiple cloning site)
选择性：选择标记基因和筛选标记基因
选择标记基因 抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。 1．氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） 2．四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） 3．氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） 4．卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor） 5．琥珀突变抑制基因 supF
表达载体
就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、SD序 列、终止子等），是目的基因能够表达的载体。是否含有表达系统元 件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来 区别克隆载体和表达载体的标志。 根据受体细胞的不同可分为：
1．原核表达系统
将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中快速高效地表达、 合成基因产物的体系。
基因克隆原理和应用
Questions
• 蛋白A是一个胞浆蛋白，刺激之后会转移到 细胞核，怎么能实时观察它的入核呢？
• 在组织里检测到蛋白A和蛋白B有相互作用， 怎么能知道它们是否有直接的相互作用，以 及决定它们相互作用的序列是哪一段？
一些基本的概念
• 基因 (gene) 是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核 苷酸序列。 基因表达 (gene expression) 是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗 传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。生物体内的各 种功能蛋白质和酶都是相应的结构基因编码的。 克隆(clone) ，来源于希腊语Klon(嫩枝)。在园艺学上，克隆是指通过营养生 殖产生的单一植株的后代，很多植物都是通过克隆这样的无性生殖方式从单 一植株获得大量的子代个体。在广义上是指利用生物技术由无性生殖产生与 原个体有完全相同基因组后代的过程。在生物学上，是指选择性地复制出一 段DNA序列（分子克隆）、细胞（细胞克隆）或是个体（个体克隆）。 基因克隆（gene clone）基因克隆是指在体外对DNA按照即定目的和方案进 行人工重组,将重组DNA进行扩增以获得目的基因的大量拷贝。
选择性：蓝白斑筛选
lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质 粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂 IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然 而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补 能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的 筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板 37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
1.质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质。细菌如失去染色体，则不能生存；然而 细菌失去质粒后仍能生存。这是由于染色体DNA携带的基因所编码的产物，在细菌新陈代 谢中是生存所必须者；而质粒携带的基因所编码的产物并非细菌的生存所必须者。因此质 粒可以在细菌间传递与丢失。
2.质粒的传递（转移）是细菌遗传物质转移的一个重要方式。有些质粒本身即具有转 移装置，如耐药性质粒（R质粒）；而有些质粒本身无转移装置，需要通过媒介（如噬菌 体）转移或随有转移装置的质粒一起转移。获得质粒的细菌可随之而获得一些生物学特性， 如耐药性或产生细菌素的能力等。 3.质粒可自行失去或经人工处理而消失。在细菌培养传代过程中，有些质粒可自行从 宿主细菌中失去。这种丢失不像染色体突变发生率很低，而是较易发生。用紫外线、吖啶 类染料及其他可以作用于DNA的物理、化学因子处理后，可以使一部分质粒消失，称为消 除。目前学者们感兴趣的是如何通过人工处理消除耐药质粒或与致病性有关的质粒。 4.质粒可以独立复制。质粒为DNA，有复制的能力，质粒的复制可不依赖于染色体， 而在细菌胞浆内进行。这一特性在基因工程中需扩增质粒时很有用处，因可使细菌停止繁 殖而质粒仍可继续复制，从而可获得大量的质粒。
2．真核表达系统
使外源基因在真核细胞中表达的体系。
原核表达系统的重要调控元件：
• • • 启动子 SD序列 终止子
原核表达系统的重要调控元件：
• 启动子 (promoter, P )
启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列， 它是基因表达不可缺少的重要调控序列，没有启动子，基因就不能转录 • 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 • 具有保守序列：-10区（pribnow box）：TATAAT -35区
1972年把一种猿猴病 毒的DNA与λ噬菌体 DNA用同一种限制性 内切酶切割后，再用 DNA连接酶把这两种 DNA分子连接起来， 于是产生了一种新的 重组DNA分子，从此 产生了基因克隆技术。
Stanely Cohen 1986 Nobel Price
1973年，科恩 （S.Cohen）等人把 一段外源DNA片段与 质粒DNA连接起来， 构成了一个重组质粒， 并将该重组质粒转入 大肠杆菌，第一次完 整地建立起了基因克 隆体系。
amp R
选择性：选择标记基因和筛选标记基因
筛选标记基因 筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入到 一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。 1．插入失活 2．α-互补（α-complementation） α-互补(Alpha complementation) ： 噬菌体载体的基因间隔区插入E.coli的一 段调节基因及lac Z的N端146个氨基酸残基编码基因，其编码产物为 β—半乳糖 苷酶的α片段。突变型lac - E.coli 可表达该酶的W片段（酶的C端）。单独存在 的α及W片段均无β半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片 段时，宿主细胞内才有β半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物， 这就是所谓的 α- 互补。
1. 如何寻找合适的载体/质粒？
1）质粒的命名 2）质粒各个元件的识别 3）质粒的分类 – 克隆载体 – 表达载体
转染受体细胞
克隆载体 （pBR322, pUC19）
克隆载体主要用于扩增或保存 DNA 片段，是最简单的载体。大多是高拷贝的 载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导 入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克 隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体目的在于复制足够多 的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在 菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。 ①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。 ②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。 ③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。 这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。 ④容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。 ⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列 进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才用于克隆操作
5.可有几种质粒同时共存在于一个细菌内。因质粒可独立复制，又能转移入细菌和自 然失去，因此就有机会出现几种质粒的共存。但是并非任何质粒均可共存，因发现在有些 情况下，两种以上的质粒能稳定地共存于一个菌体内，而有些质粒则不能共存。
质粒
基因克隆
• 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术， 可概括为∶分、切、连、转、选。