此， 多细菌感染性炎症时， 循环血液中的细胞因子含 量能否代表器官中细胞因子的基因表达有待研究。
＊ 本课题为北京市自然科学基金资助项目（ 编号： ７９９２０１７） １． 北京大学人民医院检验科（ 邮编 １０００４４） ２． 首都医科大学附属北京友谊医院检验科 ３． ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｘａｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ， ＴＸ７８２２９－ ３９００， ＵＳＡ △ 作者现在北京友谊医院 △△ 本 文 通 讯 作 者
北京医学 ２００５ 年第 ２７ 卷第 １０ 期
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· 论著 ·
不同器官细胞因子在多细菌感染性炎症时的
基因表达和临床意义 ＊
苏建荣 １△ 张 正 １△△ 孙东旭 ２ Ａｐａｒｎａ Ｋｒｉｓｈａｎ３ Ｇａｂｒｉｅｌ Ｆｅｒｎａｎｄａｓ３
【摘要】 目的 探讨肝、肺细胞因子基因表达与腹腔吞噬细胞上清液、循环血中细胞因子含量的关系 ， 为临床诊 治多细菌感染引发的炎症提供实验依据。 方法 将 ３０ 只小鼠分为假手术对照组（ ｓｈａｍ 组） 和盲肠结扎组（ ＣＬＰ 组） 。 采用 ＲＴ!ＰＣＲ 法检测肝脏和肺脏肿瘤坏死因子 α（ ＴＮＦ!α） 和白细胞介素 １０（ ＩＬ!１０） 的基因表达情况， 采用 ＥＬＩＳＡ 法检 测腹腔巨噬细胞上清液和循环血液中相应细胞因子含量。 结果 ＣＬＰ 组的 ＴＮＦ"α、ＩＬ!１０ 基因表 达 和 腹 腔 巨 噬 细 胞 上清液、循环血液中的相应细胞因子含量均高于 ｓｈａｍ 组。ＣＬＰ 后 １８ｈ 组与 ４ｈ 组比较， ＴＮＦ"α在腹腔巨噬细胞上清 液、循环血液中的活性均有显著性差异（ Ｐ＜０．０５） ，在肝、肺中基因表达有非常显著性差异（ Ｐ＜０．０１） ； ＩＬ!１０ 在腹 腔 巨 噬 细胞上清液和循环血液中的含量无显著性差异，而在肝、肺中基因表达有显著性差异。 结 论 发 生 多 细 菌 感 染 性 炎 症时， 肝、肺参与细胞因子的表达； 血液中细胞因子含量不能完全代表组织器官内 的 基 因 表 达 情 况 ； 多 细 菌 感 染 性 炎 症治疗应考虑靶器官细胞因子的表达状态。
【关键词】 多细菌感染 细胞因子 基因表达
Ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔ ｏｒ ｇａｎｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｉｃｒ ｏｂａｃｔｅｒ ｉａｌ ｐｅｒ ｉｔｏｎｉｔｉｓ
Ｓｕ Ｊｉａｎｒｏｎｇ， Ｚｈａｎｇ Ｚｈｅｎｇ， Ｓｕｎ Ｄｏｎｇｘｕ， ｅｔ ａｌ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｎｍｉｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４４）
７． 细胞因子 ｍＲＮＡ 表达分析：使用 ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ ２０００ 分析系统分别检测内对照 ＧＡＰＤＨ 和细胞因子 ＴＮＦ!α、ＩＬ!１０ 含量， 定量分析ＰＣＲ 产物。
结果
一、腹腔巨噬细胞上清液中 ＴＮＦ!α和 ＩＬ!１０ 含 量变化
ＣＬＰ 后 ４ｈ 和 １８ｈ 组 与 相 应 ｓｈａｍ 组 ＴＮＦ!α和 ＩＬ!１０ 比较， 均有显著性差异， Ｐ＜０．０５； ＣＬＰ 后 ４ｈ 与 １８ｈ 比较， ＴＮＦ!α有显著性差异， Ｐ＜０．０５， 见表 １。
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２００３ 年至２００５ 年， 我们采用多细菌感染性小鼠模 型， 对肝、肺细胞因子基因表达与腹腔吞噬细胞上清 液、循环血中细胞因子含量的关系进行探讨， 以求找 出规律， 为临床诊治多细菌感染性炎症提供可靠的 实验依据。
材料与方法
一、材料 ＥＬＩＳＡ 试剂： 荧光标记单克隆抗体 ＴＮＦ!α、ＩＬ－ １０， 生物素标记的辣根过氧化物酶为 Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 公 司产品。ＲＮＡ 提取试剂为 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂， 购自 Ｇｉｂｃｏ 公 司。ＲＴ－ ＰＣＲ 试剂购自 Ｐｒｏｍｅｇａ 公司。ＰＣＲ 引物设计 依 据 ＭＥＤＬＩＮＥ 提 供 的 基 因 序 列 ， ＴＮＦ!α引 物 ： 上 游 ： ５’!ｃｔｇｇｇａｃａｇｔｇａｃｃｔｇｇａｃｔ !３’， 下 游 ： ５’!ｇｃａｃ－ ｃｔｃａｇｇｇａａｇａｇｔｃｔｇ !３’； ＩＬ !１０ 引 物 ： 上 游 ： ５’!ａｔ－ ｇｃａｇｇａｃｔｔｔａａｇｇｃｔｔａｃｔｔｇｇｇｔｔ!３’， 下游： ５’!ａｔｔｔｃｇｇａｃａｇａｇ－ ｇｔａｃａａａｃｇａｇｇｔｔｔ!３’； ＧＡＰＤＨ 引物： 上游： ５’!ａｃｃａｃａｇｔｃ－ ｃａｔｇｃｃａｔｃａｃ!３’， 下游： ５’!ｔｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｔｔｇｃｔｇｔａ!３’。 二、方法 １． 多细菌感染性炎症模型： Ｃ５７ＢＬ／６ 小鼠（ 购于 首都医科大学实验动物中心） ３０ 只， 分为两组， 每组 １５ 只。实验组采用盲肠结扎法（ ＣＬＰ） ［２］。假手术对照 组（ ｓｈａｍ 组） 同时切开腹壁但不结扎和穿孔盲肠。 术后 ４ｈ 和 １８ｈ 分别取小鼠肝脏、肺做细胞因子基因 表达分析， 取血液做细胞因子含量测定。 ２． 腹腔巨噬细胞上清液的采集：分别向 ｓｈａｍ 组 和实验组小鼠腹腔注入 ２ｍｌ ＰＢＳ 溶液， 吸取小鼠腹 腔液， 其中含有巨噬细胞。测定上清液中细胞因子的 含量。 ３． 细胞因子含量免疫分析： 采用 ＥＬＩＳＡ 法测定 细胞因子 ＴＮＦ!α和 ＩＬ!１０ 含量。 ４． 肝脏、肺脏总 ＲＮＡ 的提取： 采用 Ｔｒｉｚｏｌ 法［２］。 ５． ＲＮＡ 完整性的检测： 制备变性胶后， ５０Ｖ 电 泳约 １．５ｈ 后， 将胶块置紫外灯下， 观察 ＲＮＡ 的完整 性， 记录 １８Ｓ、２８Ｓ 条带的位置。 ６． 逆转录反应获得 ｃＤＮＡ、ＰＣＲ 扩增和琼脂糖 凝 胶 电 泳 和 产 物 分 析 ［２］： ① 逆 转 录 反 应 获 取 ｃＤＮＡ 的方法： 取 １μｇ 总 ＲＮＡ 于微量离心管中， 置 ７０℃温 育 ５ｍｉｎ， 离心后冰浴 ５ｍｉｎ。离心管中加入混合液 ［ ＭｇＣｌ２， ２５ｍｍｏｌ／Ｌ； １０×逆 转 录 缓 冲 液 ； ＲＮＡ 酶 抑 制 剂 ； 逆 转 录 酶 ； Ｏｌｉｇｏ（ ｄＴ） １５ Ｐｒｉｍｅｒ； ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ］ ， 终 容 量为 ２０μｌ。置于 ４２℃反应 １５ｍｉｎ， ９５℃加热５ｍｉｎ 后，
北京医学 ２００５ 年第 ２７ 卷第 １０ 期
冰浴 ５ｍｉｎ， 以 灭 活 逆 转 录 酶 并 防 止 ｃＤＮＡ 相 互 结 合。② ＰＣＲ 扩增和琼脂糖凝胶电泳和产物分析： 用 ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ 稀释 ｃＤＮＡ 至 １００μｌ。在 １００μｌ ＰＣＲ 扩增 管中， 加入 １０μｌ 稀释好的 ｃＤＮＡ， １．８μｌ 的 １０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ 混 合 液 ， ７．５μｌ 的 ２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２， ９．８μｌ 的 １０×逆转录缓冲液， ５０ ｐｍｏｌ 的上游引物， ５０ ｐｍｏｌ 的 下 游 引 物 ， ２．５Ｕ 的 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 和 ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ， 终容量为 ５０ μｌ。ＴＮＦ!α和 ＩＬ!１０ 的 ＰＣＲ 反应退火温 度 分 别 为 ５９℃和 ５８℃， ３８ 个 循 环 。 上 载 １０μｌ ＰＣＲ 产物于 １．５％琼脂糖凝胶板上， 电泳。
与 ｓｈａｍ 组比较 ＊Ｐ＜０．０５； 与 ＣＬＰ 后 ４ｈ 比较 ＃Ｐ＜０．０５
二、循环血液中 ＴＮＦ!α和 ＩＬ!１０ 含量变化 在腹腔巨噬细胞上清液和循环血液中， 实验组 ＴＮＦ!α和 ＩＬ!１０ 含量均高于 ｓｈａｍ 组。ＣＬＰ 后 １８ｈ 与 ４ｈ 比较， ＴＮＦ!α变化有显著性差异（ Ｐ＜０．０５） ； 而 ＩＬ! １０ 变化无显著性差异， 见表 ２。
【Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ】 Ｐｏｌｙ"ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
多细菌感染性炎症是临床常见的感染性疾病。 感染后引起机体炎症反应， 释放大量细胞因子。炎症 反应的失调可导致组织细胞损伤， 包括肺、肝、肾在 内 的 多 器 官 功 能 衰 竭 ［ １］ 。 细 胞 因 子 是 联 系 细 胞 间 相 互作用的一种化学物质， 在多细菌感染性炎症的临 床诊治中起重要作用。但由于细胞因子由旁分泌或 自分泌方式释放，在少数细胞范围内发挥作用， 而不 像激素等物质可通过血流迅速到达全身靶器官， 因
表 １ 多细菌感染性炎症腹腔巨噬细胞上清液中细胞因子
的含量（ ｎ＝３０） （ ｘ! ±ｓ， ｐｇ／ｍｌ）
细胞因子
ＣＬＰ后 ４ｈ
ｓｈａｍ组
实验组
ＣＬＰ后 １８ｈ
ｓｈａｍ组
实验组
ＴＮＦ!α ４００±４６
８２０±５８＊
６３５±５５ １２１０±１０６＊＃
ＩＬ!１０
４３５±４２
７±１０２＊
【Ａｂｓｔｒ ａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ， ｌｕｎｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｓｅｒａ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｃｅｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ（ ＣＬＰ） ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０ Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｓｈａｍ ｇｒｏｕｐ （ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ） ａｎｄ ＣＬＰ ｇｒｏｕｐ． ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｌｕｎｇｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ"αａｎｄ ＩＬ"１０ ｍＲＮＡ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ ｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ ＲＴ"ＰＣＲ） ． ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＴＮＦ"αａｎｄ ＩＬ"１０ ｉｎ ｓｅｒａ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＴＮＦ"αａｎｄ ＩＬ"１０ ｉｎ ｓｅｒａ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｆｌｕ－ ｉｄ ｏｆ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｌｕｎｇｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ＣＬＰ ｔｈａｎ ｉｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｓｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌｓ． ＴＮＦ"αｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｍｏｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｆｒｏｍ ４ ｈｒｓ ｔｏ １８ ｈｒｓ ｂｏｔｈ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｌｕｎｇｓ （ Ｐ＜０．０１） ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｒａ ａｎｄ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｆｌｕｉｄ（ Ｐ＜０．０５） ． Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＩＬ"１０ ｉｎ ｓｅｒａ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｃｈａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ４ ｈｒｓ ｔｏ １８ ｈｒｓ， ｗｈｉｌｅ ｔｇｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｌｕｎｇｓ ｗｅｒｅ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｉｎ １８ ｈｒｓ ｔｈａｎ ｉｎ ４ ｈｒｓ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｌｕｎｇｓ ａｒｅ ｏｒｇａｎｓ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃａｎｎｏｔ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈａｔ ｉｎ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｂｏｄｉｅｓ ｓｕｆｆｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐｌｅ"ｍｉｃｒｏｂａｒｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．