质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液
溶液I充分重悬
抽提
溶液II裂解
酒精沉淀
溶液III中和
离心洗涤
沉淀
干燥溶解
质粒DNA溶液
质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 ➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
基因组DNA－其它方法
根据核酸分离纯化方式的不同有：
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高 pH值洗脱。
快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低
pH值洗脱。
差速离心法原理
➢ 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
➢ 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
内容
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
DNA提取的基本步骤
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提离心洗涤DNA液细胞裂解上层溶液
干燥溶解
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
• 磁珠
适用于纯度要求高的实验。 磁性微粒挂上不同基团可吸附
不同的目的物，从而达到分离
目的。
基因组DNA－其它方法
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离 各种内容物
DNA提取的几种方法
非染色体DNA的提取 ➢ 质粒DNA的提取 • 碱裂解法 • 煮沸法
➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
DNA提取及常见问题分析
内容
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
前言
DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此DNA的提取是分子生物学实验技术中最重要 、最基本的操作 。
DNA提取的几种方法
染色体DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 其它
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/V)
0.1%（V/V） 使用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏
；
➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
材料准备
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
➢ 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
➢ 使用处于对数期的新鲜菌体（老化 菌体导致开环质粒增加）
➢ 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞）
➢ 培养时应加入筛选压力，否则菌体 易污染，质粒易丢失
组份
Tris-HCl
EDTA
（pH8.0） （pH 8.0 ）
终浓度 10 mM
20 mM
NaCl 0.4M
SDS 2%
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA－其它方法
根据细胞裂解方式的不同有：
➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相
中；
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
CTAB
PVP40 β-巯基乙醇
终浓度 100 mM
20 mM
1.4M
3%(W/V)
5%(W/V)
2%（V/V） 使用前加入
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方