华西药学杂志W C J ・P S 2009,24(5)ζ536～537作者简介:曹俊涵(1984-),女,四川自贡,正攻读药物分析专业的硕士学位。
3通讯作者(Corres pondent author ),Email:zdan321@HP LC 测定盐酸美金刚胺及其前药的脂水分配系数曹俊涵,毛惠英,张 丹3,粟 立,李文莉(四川大学华西药学院,四川成都610041)摘要:目的 测定盐酸美金刚胺(MH )及其前药(P MH )的脂水分配系数。
方法 用HP LC 法测定脂水两相药物的浓度,采用恒温摇瓶法测定脂水分配系数;色谱柱为Luna C 18,流动相为甲醇-水-三乙胺(70ζ30ζ0.5,磷酸调pH7),检测波长为225n m,流速1.0m l ・m in -1。
结果 MH 及P MH 脂水分配系数分别为2.09、227.05。
结论 P MH 的脂水分配系数显著大于MH,证明P MH 比MH 具有更高的脂溶性,推测其具有良好的血脑屏障通透性。
关键词:盐酸美金刚胺;P MH;脂水分配系数;高效液相色谱法中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:1006-0103(2009)05-0536-02D eterm i n a ti on of partiti on coeff i c i en ts of m eman ti n e hydrochlor i de and its prodrug P M HCAO Jun -han,MAO Hui -ying,ZHANG Dan 3,S U L i,L IW en -li(W est China school of Phar m acy,S ichuan U niversity,Chengdu,S ichuan,610041P .R.China )Abstract:O BJECT I VE To deter m ine the partiti on coefficients of me mantine hydr ochl oride (MH )and its p r odrug (P MH ).M ETH 2OD S The partiti on coefficient in trichl or methane /water syste m was measured using shaking flask method by deter m ining the drug con 2centrati ons in t w o phases .Luna C 18colu mn (phenomenex 150mm ×4.6mm,5μm )was used with detecti on wa welength at 225n m,and the mobile phase consisted of methane -water -triethylam ine (70ζ30ζ0.5,adjust t o pH7.0with phos phoric acid ).The fl ow rate was 110m l ・m in -1.RESUL TS The partiti on coefficients of MH and P MH were 2.09and 227.05,res pectively .CO NCL US I O N The partiti on coefficient of P MH is higger than that ofMH which p r oves P MH shows higher li pos olubility than MH,and i m p lies that the infiltrati on ability of MH acr oss BBB is increased in the for m of P MH.Key words:Me mantine hydr ochl oride;Pr odrug;Partiti on coefficient;HP LC CLC nu m ber:R917 D ocu m en t code :A Arti cle I D :1006-0103(2009)05-0536-02 盐酸美金刚胺(me mantine hydr ochl oride,MH )是第一个在阿尔茨海默氏病和血管性痴呆方面有显著疗效的NMDA 拮抗剂,已被F DA 批准用于中、重度AD 的治疗[1～3]。
为增加盐酸美金刚胺的脂溶性,提高其通过血脑屏障(BBB )的能力,目前已设计并合成了盐酸美金刚胺前药(P MH ),其理化性质未见报道。
从化学结构分析可能具有脑靶向性,实际药理药效还处于处于基础研究阶段。
现采用恒温摇瓶法测定MH 及P MH 脂水分配系数,证明P MH 比MH 具有更高的脂溶性。
推测其具有良好的透过BBB 的能力,可提高药物在脑内的浓度。
1 实验部分111 仪器与试药LC -10ATv p 液相色谱仪系统(日本岛津);PHS -3C 型酸度计(成都方舟科技开发公司);盐酸美金刚胺(MH,含量99.5%)及盐酸美金刚胺前药P MH (含量9911%)(四川大学化学学院);盐酸金刚烷胺(市售);水为重蒸水,其余试剂均为化学纯。
112 方法与结果11211 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Luna C 18(150mm ×4.6mm ,5μm );流动相为甲醇-水-三乙胺(70ζ30ζ0.5,磷酸调pH7);流速为1.0m l ・m in -1;检测波长为225nm 。
理论板数按盐酸美金刚胺衍生物峰计算应不低于3×103。
盐酸美金刚胺衍生物峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。
11212 盐酸美金刚胺的测定 取盐酸美金刚胺适量,精密称定,用三氯甲烷制成1mg ・m l -1的溶液;取该溶液适量,与磷酸盐缓冲溶液(pH7.8～8.0)混合,置恒温振荡仪(37℃、281r ・m in -1)上振荡16h 后,4℃避光静置2.5h 。
分取脂水两相溶液,离心,各取1m l,用甲醇稀释至50m l;各取10μl,加10μl内标溶液(20μg ・m l -1盐酸金刚烷胺甲醇溶液),60℃水浴中挥干,加衍生化试剂(苯甲酰氯丙酮溶液)100μl 和三乙胺10μl,混匀,4℃下避光放置30m in,60℃水浴中挥干,加100μl 流动相溶解后,取20μl 进样测定。
采用内标标准曲线法计算脂水两相中盐酸美金刚胺的浓度,以两相浓度比为盐酸美金刚胺的脂水分配系数。
11213 P MH脂水分布系数测定 按“11212”项下方法配制P MH溶液,取水相溶液20μl直接进样测定;取脂相溶液1m l,用甲醇稀释至50m l,取10μl,于60℃水浴中挥干,用100μl流动相溶解,取20μl 直接进样测定;采用外标标准曲线法计算P MH脂水两相中的浓度,以两相浓度比为P MH的脂水分配系数。
11214 线性关系与范围 分别用相互饱和的脂相和水相配制一系列浓度的MH溶液。
按“1.212”项下方法测定,以MH与内标的峰面积比对浓度进行线性回归。
两相中盐酸美金刚胺0.01～6.37mg・m l-1与峰面积的线性关系良好,得回归方程分别为: Y水相=01869X+0.029(r=0.9995)和Y脂相= 01964X+0.089(r=0.9996)。
P MH按上述操作直接进样,以P MH的峰面积对浓度进行线性回归。
P MH水相溶液0.39～50.50μg・m l-1与峰面积的线性关系良好(r=0.9996),回归方程为:Y=11551×103X+41755×103。
11215 两相体积比的考察 按“1.211”项下方法,测定脂水两相的体积比分别为5ζ1、3ζ1、1ζ1、1ζ3、1ζ5时MH及P MH的脂水分配系数。
经考察,两种药物在脂水两相的体积比为1ζ1时均测得最大脂水分配系数。
因此,确定测定脂水分配系数的两相体积比为1ζ1。
1.216 平衡时间及平衡温度的考察 取两相体积比为1ζ1,按“11212”项下方法试验,分别测定经恒温振荡1、3、5、12、16、24h后MH与P MH的脂水分配系数。
经考察,药物两相平衡所需时间均为16h。
取两相体积比为1ζ1,按“11212”项下方法试验,分别在25℃、37℃下恒温振荡达平衡后测定MH 与P MH的脂水分配系数。
经考察,振荡温度对其脂水分配系数的影响较小。
1.217 脂水分配系数的测定与比较 分别精密称取MH与P MH适量,照“11212”项下方法测定其脂水分配系数并进行比较。
结果,P MH的脂水分配系数为277.05,MH的脂水分配系数为2.09。
试验表明,P MH的脂水分配系数明显大于MH的脂水分配系数,显示前者具有较高的脂溶性。
2 讨论由此盐酸美金刚胺(MH)无紫外吸收,采用常规HP LC-UV法无法检测,因此,须建立柱前衍生化法。
P MH有较强的紫外吸收,可用HP LC-UV法直接测定。
以衍生化试剂苯甲酰氯,与MH发生亲核取代反应转化为芳香衍生物,可增大其紫外吸收和脂溶性,从而可用UV法检测。
试验表明,所建方法专属性强,准确度及精密度较高,可用于测定MH 及其P MH脂水分配系数的测定。
选择合适的脂水两相溶剂对于准确测定MH、P MH的脂水分配系数十分重要。
二氯甲烷和三氯甲烷均为脂相溶剂。
以二氯甲烷为脂相时,MH在水中几乎无分布,即脂水分配系数极大;以三氯甲烷为脂相时,MH在水相中有一定分布,故确定以三氯甲烷为脂相溶剂。
进行水相溶剂选择时,考虑到MH、P MH均为有机弱碱盐,为增大其脂溶性,选用呈弱碱性的磷酸盐缓冲液(pH7.8～8.0)作为水相。
考察中发现,在相对较低温度下,MH和P MH 的脂水分配系数略有增加,这种情况与通常情况下物质溶解度随温度降低而减小有所不同。
可能是由于温度对两相溶解度影响程度不同引起的比值变化。
由于人体正常体温为37℃,因此,选择在此温度下考察脂水分配系数,可为P MH的进一步研究提供更有参照性的实验参数。
文中侧重于体外脂水分布系数的考察,相关体内分布研究及组织中的药物浓度的HP LC测定方法另文发表。
参考文献:[1] 张楠,陈焱,杜红坚.盐酸美金刚胺治疗阿尔茨海默病的临床研究[J].中国精神疾病杂志,2008,1:6-9.[2] 李玉萍,李卓容,曹钰,等.金刚烷胺衍生物的合成和生物活性[J].药学学报,2007,42(4):392-395.[3] 葛孝忠,应黄慧,陈晓,等.金刚烷胺类药物的研究进展[J].中国医药工业杂志,2003,34(11):583-586.收稿日期:2008-12735第5期曹俊涵,等。