微生物学实验报告（格式标准参考）(生命科学专业，生物技术专业)*****目录索引实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 (3)实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 (4)实验三常用培养基的配制 (6)实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别 (7)实验五、微生物大小的测定与显微计数 (9)实验六环境中微生物的检测和分离纯化 (10)实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应 (12)实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化 (13)课程名称：微生物学实验班级：化生系生命科学本科实验日期：指导教师：黎勇实验一油镜的使用和细菌的简单染色法〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。
〔基本原理〕1.N·A=n·sinα2.D=λ/2N.A3.目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。
已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。
4.用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。
〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis. S.arueus菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。
〔方法步骤〕：（一）油镜的使用镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。
（二）细菌的简单染色法：涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察（三）细菌运动性的观察取洁净盖玻片，四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察〔结果分析〕1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。
（描绘时按视野实际大小5－10倍绘制）菌名：大肠杆菌菌名：金黄色葡萄球菌放大倍数：100×10（×5）放大倍数：100×10（×5）特殊结构：无特殊结构：无视野观察下微生物的形态2、油镜使用时为什么必须干燥装片？防止水油分层，光受到折射而影响油镜性能的发挥〔实验讨论〕首次实验中有几个要点：一是按无菌操作取用菌；二是涂片技术的掌握；三是油镜使用技术。
凡实验中学生的所思所想，如无菌操作技术要点、自行处理实验材料、失败与思考等均可进行讨论（如涂片时蒸馏水不宜过多、取用菌时防止菌被灼烫变形、取菌宜少不宜多等均是可以讨论的内容）。
实验二细菌的革氏染色与芽孢染色〔目的要求〕观察细菌菌落的特征；掌握简单染色法、革兰氏染色法的原理及操作步骤；在油镜下观察细菌个体形态；学习环境中微生物的检查方法，并加深对微生物分布广泛性的认识〔器材用具〕E.coli\B.subtilis\S.aureus.的斜面培养物（18－24小时）以及菌落平板各一个；染液：草酸铵结晶紫、划兰氏染液、卢戈氏碘、95%的乙醇、蕃红；无菌水、显微镜、载片、滤纸、液体石蜡是、、擦镜纸、接种环。
〔方法内容〕：（一）实验室环境中微生物的检查（二）革兰氏染色法涂片固定冷却结晶紫染色1min水洗碘媒染1min95%乙醇30-60s水洗番红复染2－3min水洗干燥油镜镜检（三）芽孢染色涂片固定孔雀绿加热染色（勿干）5min水洗番红复染1min水洗镜检〔结果分析〕实验结果被染成紫色者即为革兰氏阳性，被染成红色者为革兰氏阴性；菌体染成红色，芽孢被染成绿色。
菌名：大肠杆菌菌名：金黄色葡萄球菌放大倍数：100×10（×5）放大倍数：100×10（×5）染色反应：红色（阴性）染色反应：紫色（阳性）菌名：枯草芽孢杆菌放大倍数：100×10（×5）染色反应：紫色（阳性）图1芽孢（绿色）图2枯草芽孢杆菌芽孢形态图〔实验讨论〕严格掌握脱色程度，是成败的关键。
若脱色时间过度，则阳性菌初时之紫色脱出，复染成红色，误成阴性，反之脱色时间不足，阴性菌在初染时的紫色未能脱出，复染时不能染成红色，误以为阳性菌；涂片不能厚；卢弋氏碘即用即配。
作业1、绘出所观察到到细菌的视野图，并说明染色反应。
2、哪些因素会影响到革兰氏染色结果的正确？其中是关键的一步是什么？菌龄及培养条件和染色技术是最主要的，关键是脱色。
3、怎样对未知菌进行革兰氏染色，以证明你的结果的正确？与已知菌混合涂片比较。
实验三常用培养基的配制〔目的要求〕了解培养基的配制原理；了解培养基常规配制程序；了解培养基过程各环节的要求和注意事项。
了解半合成培养基的配制原理，学习掌握肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基的配制方法。
〔器材用具〕等配各种培养基的组成成分，琼脂、1N NaoH溶液1N HCl天平或台秤高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。
药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸报纸等。
〔方法步骤〕(一)玻璃器皿的洗涤和包装以小组为单位清洗、控水，按9个为一组，分别用报纸包好并放入烘箱中等待灭菌。
(二)液体及固体培养基的配制过程原料称量（按配方次序）溶解调节ｐH过滤澄清分装塞棉塞和包札灭菌分别按教材配方配制牛肉膏蛋白胨、马铃薯液体及固体培养基。
(三)培养基的分装用玻璃漏斗，橡皮管，小玻璃管及弹簧夹制作分装装置选用15×150平口试管或150mL锥形瓶贴上标签分装（至试管高度1/4-1/3，斜面制作用1/5，半固体用1/3）要求：每人制作斜面3支。
其余分装至锥形瓶中。
(四)棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎分别制作试管及锥形瓶棉塞并塞好好以牛皮纸包装头部。
(五)培养基的灭菌培养基用湿热法灭菌；皿用干热法分别灭菌。
(六)斜面和平板的制作（下次试验完成）(七)培养基的无菌检查（下次实验完成）(八)无菌水的制备同时制作无菌生理盐水，置锥形瓶中备用。
〔结果分析〕以斜面接种培养验证培养基配制效果；以平板制作及接种24小时培养验证灭菌效果；简述移液管包装的注意事项。
〔实验讨论〕灭菌器的灭菌效果必须间隔一段时间，加以验证，主要方法除无菌检查外，还通过压力试纸同时灭菌来验证其压力与温度；培养基通常成批制作备用。
但制作后，其贮藏时间有一定限制，一般室温条件下不超过三周；冰箱4℃条件下可贮藏半年，过期不能用。
作业：1、记录培养基的成分和名称2、分析所配制培养基的碳源、氮源、能源及无机盐、维生素的来源。
所配制均为天然培养基，各成分主要来自有机质，微量元素可以由自来水提供。
3、什么是天然培养基？什么是半合成、合成培养基？实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别〔目的要求〕观察并掌握酵母菌霉菌的菌落特征、个体形态、生长及繁殖方式。
学习酵母死活细胞的鉴别方法。
〔材料用具〕酿酒酵母、红酵母、假丝酵母；(酿酒酵母和红酵母菌落平板各一个。
酿酒酵母豆芽汁斜面及酿酒酵母醋酸钠斜面各一支，假丝酵母加盖片培养的平板)；7.6%孔雀绿染液，0.5%蕃红染液，苏丹黑染液，二甲苯，中性红染液，碘液；目镜测微尺、镜台测微尺；载片及盖片。
〔方法步骤〕(一)菌落特征的观察(二)个体形态与出芽(三)子囊孢子的观察(四)酵母死活细胞的观察。
〔结果分析〕描述酿酒酵母霉菌的菌落形态特征；绘图酿酒酵母的菌体、出芽方式及细胞细节；（一）酵母的菌落湿润，大而隆起，颜色多样，正反面颜色一致，不透明，边缘整齐；菌名：酿酒酵母放大倍数：100×10（×5）特殊结构：芽（出芽繁殖）（二）霉菌菌落特征：干燥，正反面及中央与边缘不一致；大而疏松。
（如右图）酵母营养细胞酵母出芽芽体酵母死细胞（蓝色）菌名：青霉（Penicillium）菌名：毛霉（Circinella）放大倍数：100×10（×5）放大倍数：100×10（×5）特殊结构：分生孢子梗（帚状分枝）特殊结构：孢子囊足细胞菌名：曲霉（Aspergillus）菌名：根霉（Rhizopus）放大倍数：模式图放大倍数：100×10（×5）特殊结构：足细胞特殊结构：假根〔实验讨论〕作业：1、绘图说明所观察到的酵母菌、霉菌的形态特征。
实验五、微生物大小的测定与显微计数〔目的要求〕学习并掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法；了解血细胞计数板的构造及计数原理，掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
〔材料用具〕啤酒酵母；显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺；血球计数板；盖玻片，载玻片，滴管，试管，无菌水，〔方法步骤〕(一)酵母细胞大小测定(1)目镜测微尺的校正(2) 细胞大小的测定(二) 显微计数法(1)镜检计数室(2)菌悬液制备及加样(3)计数(4)清洗计数板〔结果分析〕结果记录入表中。
酵母大小平均值＝±（保留小数点后2位）长轴＝短轴＝作业：1.什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺校正。
2.. 根据实验体会说明血细胞计数法的误差主要来自哪些方面？如何减少误差？3.. 在滴加菌液时，为什么要先置盖玻片然后滴加菌液？能否先加菌液再置盖玻片？4.. 用血球计数板测定微生物数量时，哪些步骤易造成误差？如何预防？计算细胞数目时此法是否可以适用？实验六环境中微生物的检测和分离纯化〔目的要求〕1、学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物的划线分离接种2、 学习掌握平板菌落计数法〔基本原理〕土壤是微生物生活的大本营，是生物多样性的重要场所，也是发扬微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多的菌株。
划线法是常用的分离与纯化方法，通过无菌操作条件下，“渐划渐稀”的效应而得到菌落纯的菌株。
平板菌落计数法是将待测样品经过适当稀释，使其中的微生物充分分散形成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌量。
这种方法为活菌计数法，广泛应用于生物制品及污染程度（含菌指数）的检测。
稀释液浓度个平板平均菌落数同一稀释度土壤）＝土壤中菌含量（个 1.03/g 〔材料与用品〕土样10g ，无菌平皿（20套）及无菌水，牛肉膏蛋白胨平板（2只）；取液器（0.5mL 及1mL 各三支）；无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，记号笔，酒精灯，火柴，试管架〔方法步骤〕1、周围环境中微生物的检测平板分4个区做好标记 用未洗的手指及肥皂洗过的手指（1次、2次、3次，或其它）分别在四个区上涂抹 倒置到37℃培养24小时观察结果。