外蛋白等。 ➢ 高通量：不受样本数据限制，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的
样本的差异蛋白分析； ➢ 结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和
丰富的结构信息； ➢ 自动化程度高：液质联用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。
乙酰化修饰定量蛋白质组学含案例
5 乙酰化修饰实验流程
存。 2、原始样本湿重大于1g，根据不同样本得率情况尽量多提供
原始样本。 3、提得的蛋白大于5mg，可完成一次正常富集。若样本珍贵难
获取，最少2mg可完成一次实验。
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16 乙酰化非标定量详细实验步骤
2：蛋白质定量 (1) 可以采用Bradford方法及其他方法定量初步 (2) 定量取各组样本的蛋白质进行SDS-PAGE电泳，考染定量，根据每个涌道 染色情况微调蛋白浓度，保证后续实验中每组样本的蛋白量相同。
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6 乙酰化修饰实验结果示例
质谱扫描完毕，得到质谱信号总图
小鼠的肌肉样本：乙酰化修饰 实验（4例样本：A、B、C、D）
1: 提取各组蛋白质，定量并 用胰酶酶切；
2. 各组肽段纯化，并用乙酰 化修饰抗体进行富集；
3. RP分离和质谱分析.
4: 不同样本中乙酰化修饰的 差异表达可通过二级质谱中峰 面积确定
横坐标是洗脱时间，纵坐标是信号强度。
5. 根据该肽段的二级质谱峰 图，结合数据库检索，得到蛋 白的定性及定量信息。
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7 乙酰化修饰实验结果示例
4例样本共鉴定到1449个蛋白，肽段6879个，乙酰化修饰肽段637个。乙酰 化修饰的差异分析如下：
两两比较 B/A C/B D/C C/A D/A
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乙酰化修饰非标定量技术简介
2
蛋白质的乙酰化修饰是在乙酰基转移酶的作用下，蛋白质的赖氨酸残基 上添加乙酰基的过程，是细胞控制基因表达、蛋白质的活性或生理过程的一 种机制。
最近的调查表明，蛋白质的赖氨酸残基的乙酰化普遍存在于人体的代谢 酶之中，具有调节代谢通路及代谢酶的活性。乙酰化是一个普遍和重要的蛋 白质翻译后修饰，主要集中在对细胞染色体结构的影响以及对核内转录调控 因子的激活方面 ，还影响参与细胞周期和新陈代谢、肌动蛋白聚合控制，蛋 白的乙酰化状态调节受损的癌症和多聚谷氨酰胺疾病。蛋白质的乙酰化具有 很高的功能特异性，与肿瘤等等疾病密切相关，也是目前正在开发的抗癌药 物的靶点。通过高通量的蛋白质组研究和不同物种的代谢通路研究发现，在 生理状况下，存在着大量非细胞核的蛋白质被乙酰化修饰，具有广泛的生物 学意义。 乙酰化修饰定量蛋白质组学含案例
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18 乙酰化非标定量详细实验步骤
4： 除盐，此步操作是将实验过程和相关buffer的盐除去，以便于 后续分析。
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4乙酰化修饰非标定量技术优势
➢ 乙酰化抗体：特异性识别乙酰化赖氨酸残基；精准锁定目标范围。 ➢ 灵敏度高：可检测出低丰度蛋白； ➢ 分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等
； ➢ 适用范围广：可以对任何类型的蛋白质乙酰化进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和胞
蛋白质样品制备
样品及实验预判
酶解
乙定性定量蛋白质组学结果
统计学、生物信息分析
乙酰化修饰实验流程。
1：收集不同组别的样本并分别提取蛋白质； 2：蛋白质经过还原，封闭后用胰蛋白酶酶切； 3：各组样本肽段进行纯化； 4：各组样本的肽段分别用乙酰化抗体试剂进行富集，并RP分离馏分； 5： Q-Exactive 质谱检测，定性及定量分析； 6：流程化生物信息分析及个性化设计生物信息服务
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箱线图
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GO 富集分析
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14 高阶（客制化）信息分析
详见信息分析PDF
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15 乙酰化非标定量详细实验步骤
1：蛋白质提取 提供专业的样本制备，与后期翻译后修饰富集、液相、质谱完美对接。
注意事项： 1、样本不要反复冻融。收集后立即放于液氮中或-80°冰箱保
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17 乙酰化非标定量详细实验步骤
3：酶切，富集
(1) 每组样本（各5mg）分别加入-20℃预冷的丙酮（丙酮：样品体积比=6：1），颠 倒混匀，-20℃沉淀30min~4h
(2) 12000rpm 离心15分钟，弃上清，用lysis buffer充分混悬溶解样品； (3) 加入还原试剂2μL，混匀，60 ℃反应1h； (4) 加入半胱氨酸封闭试剂1μL,室温处理10分钟； (5) 按照酶：蛋白质=1：100的比例加入trypsin酶,37℃酶解过夜（16h）； (6) 收集肽段，纯化，真空冷冻干燥。 (7) 乙酰化抗体富集 (8) RP分离 (9) 质谱检测
显著差异 189 202 248 243 273
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鉴定到的蛋白列表-结果
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乙酰化修饰定量蛋白质组学含案例
鉴定9到的肽段列表-结果
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10 乙酰化修饰实验结果示例 数据交盖图生物信息
原始数据表达量图
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表达量分布图
3 乙酰化修饰非标定量技术原理
技术原理
赖氨酸发生乙酰化的蛋白对各种生物功能进行调控。实验基于特异性识 别乙酰化赖氨酸残基的乙酰化抗体，对含有乙酰化修饰的赖氨酸肽段进行 富集。乙酰化之后的肽段，质量发生42Da 的质量变化，基于非标定量的 质谱方法对乙酰化肽段进行鉴定。
如：组蛋白乙酰化多发生在核心组蛋白N一端碱性氨基酸集中区的特定 赖氨酸残基，将乙酰辅酶A的乙酰基转移到赖氨酸的sNH3+中和掉1个正电荷 。组蛋白乙酰化水平是由组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltmnsferse ，HATs)和组蛋白去乙酰基转移酶(histone deacetylase，HDACs)共同决定 。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡，精确 地调控基因的转录和表达。