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从 50 年代末开始，组织培养技术应用进入了一个繁盛的阶段，广泛应用于生 物学和医学研究各个领域。
诱变建立遗传缺陷细胞株、杂交瘤技术制备单抗、发展细胞大量培养技术、利 用重组技术构建工程细胞株，已成为生物工程的重要生产手段。
在连续灌注培养工艺方面，美国Ohashi,Ryo等人 2001 年报道采用 2L一次性生 物反应器灌注培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体，以Becton Dickenson Cell Mab+10% 胎牛血清+1％聚醚F-68 为培养基，最高活细胞密度超过 1×107cells/ml；2001 年瑞士 Heine, Holger等人用带超声细胞分离器(UCS)的连续灌注搅拌罐生物反应器培养鼠 杂交瘤细胞生产单克隆抗体，稳态培养时活细胞密度超过 2×107cells/ml；2004 年德 国Thomas等人在 1L搅拌罐生物反应器中培养rCHO细胞生产人MUC-1 糖蛋白，采取 葡萄糖浓度限制的高产率灌注工艺减少有害代谢物，代谢转向TCA循环增加，活细 胞密度保持在(1～2)×107cells/ml。
在流加悬浮培养工艺方面，美国麻省理工Xie Liangzhi等人 2000 年报道在 2L生物反应器中 流加培养杂交瘤细胞，通过营养控制降低氨和乳酸的比生成速率，补充培养基包括营养成分、 胎牛血清和痕量金属，最大活细胞密度达到 1.7×107cells/mL。
二、细胞培养目的与用途
1．科学研究 （1）药物研究开发，如新药筛选，疫苗、基因工程药物、细胞工程药物
2．促生长因子、激素类物质 3．其它物质
基本元素、微量元素、促细胞贴附物质(纤粘连蛋白、层粘连蛋白 laminin、 IV 型胶原、氨基多糖类) 4．水
主要成分和生存环境,要求高纯度水。 5．温度
哺乳动物及人源细胞最适培养温度为 35℃—37℃,对低温耐受力比高温强。 39℃以上受损→死亡；不低于 0℃时（0℃-34℃），细胞能生存，但代谢降低、 分裂延缓。 6．气体环境和 pH
综上所述，动物细胞培养技术是生物制品产业化的核心技术之一，在生产中，应该系
统、全面的研究细胞培养技术对生物制品成本的综合影响，不断追求最佳的细胞培养技术，
提高生产效率，有效降低生物制品成本，提高利润率，增强产品市场竞争力。
五、细胞生存条件
1．基本营养物质 （1） 糖 六碳糖主要能源、维持渗透压，含葡萄糖 1-5%。 （2） 氨基酸 维持生存需 12 种氨基酸（精、胱、亮、异亮、赖、蛋、苯丙、苏、色、 组、酪、缬）。谷氨酰胺需量最大,缺乏时细胞生长不良。 单细胞培养或细胞量少时,所需氨基酸的种类和量增多，细胞主要利用 左旋氨基酸异构体。 （3） 维生素 细胞大部分需水溶性 B 族维生素，Vitc 不可少，1-10mg/100ml 可促进 正常细胞生长繁殖。
研究与开发、单克隆抗体制备等。 （2）基础研究，如药物作用机理、基因功能、疾病发生机理等研究。 2．生物制药 （1）疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)，多肽疫
苗（肿瘤疫苗)等。 （2）基因工程药物生产：如 EPO 等。 （3）抗体药物、基因治疗药物生产。 （4）细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等。 （5）利用细胞法体外测定生物活性物质的活性；并预测其在体内的药效和替
清大天一公司致力于动物细胞培养技术的开发和服务，跟随生物技术的发展， 针对各种生物制品特点不断开发针对性培养基新产品，建立多种细胞体系的疫苗、 抗体药物生产细胞培养技术平台，以提高相应细胞培养水平和生物制品表达水平， 促进生物制药发展。
细胞培养技术对生物制品成本的影响 1．表达量提高 通过细胞培养技术的不断改进可以充分利用现有设备，大幅度提高生物制 品表达量，降低生物制品的单位制造成本；同时，由于产量提高并不新增固定 资产投资，也带来生物制品的单位固定成本的降低。 因此提高表达量可以有效降低生物制品的单位成本，既降低变动成本，也 降低固定成本，使得制品利润率提高，市场竞争能力增强。 2．培养液成本降低 在很多使用牛血清的细胞培养液中，为牛血清支付的成本远远高于培养液 中的细胞培养基等其它成分，因此通过采用低血清细胞培养基，降低牛血清用 量，可以降低细胞培养液总成本。
在培养技术方法方面，革新进展更为迅猛，Earle、Dulbecco 等于 1943 年创建 单层细胞培养法，首建长期传代的 L-细胞系。
1948 年 Sanford 创建单细胞分离培养法，获 L-细胞纯系。 1951 年 Gey 首建人肿瘤细胞——Hela 细胞系。 1961 年 Hayflick 首建人二倍体细胞系 25 种，开辟了应用新方向。
培养基手册 MEDIA HANDBOOK
（2005）
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一、培养基的历史
体外培养（in vitro culture）包括：组织培养（tissue culture）、细胞培养（cell culture）、器官培养（organ culture）。顾名思义，就是将活体结构成分（如活体组织、 活体细胞或者活体器官等）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的 体外环境中，让其生长发育的方法。广义组织培养与体外培养同义。
脂溶性维生素如：A、D、E、K。 水溶性维生素如：B1、B2、B6、B12、泛酸、叶酸、生物素、C、烟酰 胺等。 许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，没有它们，酶便没有活性， 代谢活动将无法进行。 VA 是细胞合成糖蛋白时寡糖基的载体，对上皮细胞有重要的维护作用。 VD 参与调节钙的吸收。VE 是抗氧剂，可防止组成生物膜的磷脂中不饱和脂肪 酸被氧化。VK 缺乏会引起低凝血酶原及凝血时间延长。 叶酸是合成四氢叶酸的重要原料，四氢叶酸在核酸的生物合成和蛋白质的
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3．纯化成本低，制品安全性提高 牛血清的使用量不仅增加了细胞培养液的成本，更严重的是带来动物来源
成分、杂蛋白，以及不安全因素，这些成分越多，纯化的成本越高、生物制品 原液损失越大，生物制品的成本越大。因此采用低血清、无血清培养细胞可以 有效降低纯化成本何损失，提高生物制品成品率和利润率。 4．综合成本降低
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溶液将迅速变酸，使用时应注意。 7．湿度和光
开放培养相对湿度控制在 95%。细胞培养需避光，紫外线或可见光可造成 核黄素、酪氨酸、色氨酸等产生有毒的光产物，抑制细胞生长，降低其贴壁能 力。 8．影响细胞生长的其它因素
接触橡胶用品、收集细胞时离心速度过大、细胞接种浓度过低等。
六、细胞培养基的基本要求
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四、动物细胞培养技术平台
动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一，并以其研究 的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。专家预言：蛋白治疗药物如糖蛋白、 抗体和多肽药物仅仅只是刚刚开始进入市场，预计在下一个 10 年或 20 年会有更为 快速的发展。届时，蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求将远远超过全世界的生产 能力。
1．营养成分 氨基酸、单糖、维生素、无机离子与微量元素。
2．促生长因子及激素 3．渗透压 4．pH 5．无毒、无污染
七、细胞培养基组成及作用
1．氨基酸 组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种
氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基 酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时， 细胞生长不良而死亡。
其ห้องสมุดไป่ตู้细胞是病毒、蛋白的表达载体，细胞质量直接影响蛋白的表达量或病毒的 滴度，故筛选、驯化优质细胞是关键。而只有好的细胞培养基才可能筛选、驯化出 优质的细胞。
细胞生物反应容器也在不断发展，以转瓶、反应器为主要细胞生产设备，配合 高密度培养、微载体培养、悬浮培养技术，均需要相适应的细胞培养基以充分发挥 作用,获得高表达、高产量，降低生产成本。
需O2、CO2，通氧量过大对细胞有毒害。 CO2主要与维持pH有关，细胞培养最佳pH为 7.2—7.4，通过缓冲系统和调 节CO2含量，维持正常pH。 开放培养要求 5%CO2环境、HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)10—50mmol/ml 可防止pH变化。 含Earle’s缓冲系统的培养基适合于 5％CO2的培养条件，Hanks’缓冲系统的 培养基仅含有 0.35g/L NaHCO3，不能用于 5％CO2的环境，若放入CO2培养箱，
动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工 业化支持技术平台，以缩短产品工艺研发的时间，加快工业化进程。当前已获FDA 批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺中，占有主流优势的是搅拌式生物反 应器悬浮培养，工艺设计是流加或灌注培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战 是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量；去除所有培养环境中外源因子的污 染；更为精确有效的工艺控制手段；规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累积 的控制等。
1996 年 1 月至 2002 年 12 月美国获得成功批准的不同的治疗剂和诊断剂产品共 31 种，其中用哺乳动物细胞培养生产的就有 21 种。动物细胞培养技术已经成为一 个受到普遍信任的产业化生产技术，并逐步形成商业化操作水平。
动物细胞大规模培养技术集中在细胞系、细胞培养基和细胞生物反应容器三个 方面，构成生物制品生产的必要条件。
代体内法检测其成品的生物活性。
三、细胞培养基的定义
人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质,它是提供细胞营 养和促进细胞生长增殖的物质基础。包括：
1．天然培养基 指来自动物体液或利用组织分离提取的一些培养基，如动物血浆、胚胎浸
出液、血清和人血清，水解乳蛋白等。 2．合成培养基
人工设计、配制的培养基，如 MEM、199、DMEM、RPMI1640 等。
体外培养已经历了约一百年的发展历史，但发展初期进程比较缓慢，没有引起 很多学者的重视。直到上世纪 50 年代后期，体外培养技术才广泛应用于生物学研 究的各个领域，使这项技术得到飞速发展。现在体外培养已成为细胞工程、基因工 程、抗体工程的重要组成部分。