双 参 数 散 点 图 分 析
散点图
等高线图
密度图
FCM的主要测定指标：FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)
FCM标记方法
单标：一种单抗/tube--FL1, FSC, SSC（三参数）
双标：两种单抗/tube--FL1, FL2, FSC, SSC（四参数）
三/四标：三种单抗/tube、四种单抗/tube--FL1-FL3/4, FSC, SSC
颗粒杂质、气泡 对检测的影响
FSC：反映细胞相对大小及其表面积
外周全血细胞散射光双参数点图
SSC：反映颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性
（红细胞溶解后）
离线设门
在 线 设 门
对血液中淋巴细胞设门（R1）分析其免疫表型
B T
细胞分选
细胞表面标志物检测
从增殖的角度分类高等动物细胞
①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、 部分骨髓细胞。
“设门”就是确定阳性细胞群，去除散点部分。
指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中
想要分析的特定细胞群（细胞基本处于同一状态，有
数据显示
1. 直方图（Histogram）
可比较性）。通过“设门”得到不同的区域，从而对 其中的细胞进行单参数或多参数分析。
设门是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有
②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋 巴细胞、肝、肾细胞等。
③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神 经、肌肉、多形核细胞等等。
不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。细胞周期的时间长 短与物种的细胞类型有关。
G1 期 (gap1) ； S 期 (synthesis phase) ； G2 期 (gap2) ； M 期 又 称 D 期 (mitosis or division)
特点：检测速度快，分析样本量大；可同时分析单个细胞的多种特征；强大的分 选功能。
所用流式细胞仪（Flow Cytometer）是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 有分析型流式细胞仪和分选型流式细胞仪。
流式细胞仪的检测范围
FL1
488nm蓝色激光
FL4
带通/长通透镜 530/30 585/42 670 LP
661/16
适用染料
FITC PE, PI PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7
APC
搭配荧光素原则
1. 不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的。 2. 每个通道只能选择1种荧光素。 3. 各个通道之间的荧光素可以随意搭配
2. 二维点图（Dot Plot）
通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析。包括
3. 等高线图（Contour Plot） 在线设门和离线设门。
4. 密度图（Density） 5. 三维图（3D Plot）等
补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱 重叠时）荧光补偿是指在流式细胞多色分析中，纠正
荧光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的荧光
流式抗体荧光标记搭配
将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，区别经这些特殊处理发生选 择性凋亡的淋巴细胞亚型以及活细胞的分类。
由流式细胞仪能检测多少个通道（由有多少激光以及每激光的功能决定的）、需 要同时检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记等决定。
不推荐APC和PE-Cy5一起使用，上流式以后，容易导致补偿过度。 推荐使用Alex Fluro488和Alex Fluro647。因为这些荧光非常明亮，对激光非常 稳定，适合流式细胞仪的光谱性质，对PH值不敏感，具有水溶性。此外，他们联合使 用时发射光谱存在巨大差异，无需补偿。
分析时，使用FL2-w和FL2-A显示。 FL2-A是指荧光峰面积，反映了细胞DNA含量 （前提是用Rnase处理去除RNA）； , FL2-H是指荧光峰的脉冲高度；FL2-W是指检测荧 光峰的脉冲宽度，该值通常在做细胞周期分析时应用, 用于去除粘连细胞。
流式测细胞周期，一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个 凋亡峰(也称sub-G0期)，而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片
信号中去除任何其他的干扰荧光信号。
使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素
对应的同型对照抗体分别进行染色。
实验样本：自发荧光＋非特异荧光＋特异荧光
同型对照：自发荧光＋非特异荧光
单参数直方图分析
荧光峰的高低即在纵轴对 应的高度反映了具有此种 荧光强度的细胞在样本中 所占比例的相对多少，而 非绝对数目。
细胞结构
❖ 细胞大小 ❖ 细胞颗粒度 ❖ 细胞表面积 ❖ 核浆比例 ❖ DNA含量与细胞周期 ❖ RNA含量 ❖ 蛋白质含量 ❖ ……
细胞功能
❖ 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 ❖ 细胞活性 ❖ 细胞内/外的细胞因子 ❖ 激素结合位点、细胞受体 ❖ 蛋白磷酸化 ❖ pH值 ❖ 钙离子浓度 ❖ 细胞膜电位、线粒体膜电位
流式细胞仪分析细胞周期
依据细胞DNA含量（横坐标）： G1期：DNA复制还没开始，
也 是 DNA 含 量 最 少 的 ， 即 流 式 检测结果图的第一个峰；
S期：DNA开始复制，到完 成 复 制 ， 是 一 个 一 倍 DNA 到 二 倍 DNA 的 过 程 ， 在 流 式 结 果 图
……
1. 上机检测
单色/双色/多色样本 参数调节
电压、阈值、设门、补偿
2. 细胞分选 3. 细胞表面和胞内标志检测 4. 细胞周期(PI单染) 5. 细胞凋亡（Annexin V与PI双染）
举例：FACS Calibur可检测FL1-4四个通道的4个颜色
检测器组 所需探测器 （激光器） （PMT）位置
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）定义
流式细胞术是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态 中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体 加以分选。
研究对象为各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或 贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等。最终获得单细胞悬液（天然，机械研 磨/消化）。