Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面 开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……

PCR不只是一个方法改进 1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关 专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此 后的经营中又获得了数亿美元的分红
生物芯片
生物芯片（biochip）是近年来在生命科 学领域中迅速发展起来的一项高新技术， 主要是指通过微加工技术和微电子技术在 固体芯片表面构建的微型生物化学分析系 统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生 物组分的准确、快速与大信息量的检测。
生物芯片的分类
(1) DNA芯片(Gene chip, DNA chip, DNA microarray) (2) 蛋白质芯片(Protein chip)
影响杂交的因素

核酸分子的浓度和长度
浓度大，复性快；分子量大，复性慢

温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应
预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA
分子杂交的基本方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
Sanger双脱氧末端终止法
Maxam-Gilbert 化学裂解法
（二）基因拷贝数的分析

Southern blot

PCR技术
核酸分子杂交

分子杂交（简称杂交，hybridization）是核酸研究 中一项最基本的实验技术 杂交的基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的 性质，使来源不同的 DNA（或RNA）片段，按碱 基互补关系形成杂交双链分子（heteroduplex）
流式细胞术

流式细胞术（fluorescence-activated cell sorting, FACS）可在细胞水平上分析特定蛋 白质 流式细胞术（flow cytometry）
免疫组化

免疫组化(immunohistochemistry) 可对细胞内或组织中的特定基因表达产物进 行定位和半定量分析


蛋白芯片

蛋白芯片：是以蛋白质代替DNA作为检测对 象，比基因芯片更进一步接近生命活动的物 质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应 用前景。
芯片实验室

芯片实验室：是生物芯片技术发展的最终 目标。它将样品制备、生化反应和检测分 析的全过程集约化，形成微型分析系统。 目前，这种形式尚处于研发阶段。
基因及基因表达的定性 及定量分析策略
一、基因的结构特点

结构基因

结构基因的特点
原核生物：连续、无内含子，无需剪接加工等。 真核生物：
二、基因的定量及定性分析
基因的组成 基因的染色体位置 基因的拷贝数
（一）DNA序列测定



1965,R.Holly tRNA 1977,F.Sanger: 双脱氧末端终止法 φX174 DNA序列测定 1977,A.Maxam，W.Gilbert:化学降解法 1986, Smith: 四色荧光标记 1987, ABI公司:DNA 测序仪

原位杂交技术（in situ hybridization,ISH）的位置
(a) Somatic chromosome and nuclei of Allium fistulosum after DAPI staining and fluorescence in situ hybridization with labelled non-coding satellite sequences (green signals for Alexa 488) and 45S rDNA (red signals for rhodamine) using conventional detection systems. (b) A. fistulosum chromosomes after in situ hybridisation with the same probes. The biotinylated non-coding satellite probe was detected with QD 565 streptavidin conjugate (green signal, arrowed) yielding only very weak and few signals. In contrast, the conventional antibody detection of 45s rDNA loci (in red) resulted in a strong hybridization signal. Müller et al. Journal of Nanobiotechnology 2006 4:5 doi:10.1186/1477-3155-4-5

RT-PCR
是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达 的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测 或定量分析。
蛋白质的定性与定量分析

Western blot
步骤： 收集蛋白 样品 电泳 转膜 封闭 一抗孵育 二抗孵育 蛋白检测
SDS-PAGE和Western分析
Western

杂交印迹法(Western bloting)

Southern 印迹杂交
1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相 支持物上，用探针进行检测的方法。


Southern blot
核酸探针分子在一定条件下与结合在固相支持物上 的具有一定同源性的DNA分子可以完全或部分退火 形成双链，通过检测探针 信号，可对待检测DNA进 行定性或半定量分析。

能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶
序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态
核酸原位杂交的基本步骤
细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理

用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质
探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测

医学领域
/ 遗传病的产前诊断 致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测
疾病基因检测
会推广到大部分疾病治疗前的检测
DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、
法医物证
其他:
动、植物检疫（转基因动植物检测）
原位杂交(in situ hybridization)
将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进 行杂交，称为原位杂交。 特点


杂交双链可以在DNA与DNA链之间形成，也可在 RNA与DNA链之间形成

杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现 复性 利用探针（probe）与靶DNA杂交，可识别靶DNA 中的特异核苷酸序列 探针：探针是指带有某些标记物（如放射性同位素 32P ，荧光物质异硫氰酸荧光素等）的特异性核酸 序列片段。
Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤



待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜：
硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法

探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测

A
B
C
M
—
— —
bp
1534
994 695
— — —
515
377 237
PCR技术
发明：故事发生在1983年的春夏之交
Kary B. Mullis (1944 -)， 在Cetus公司工作期间， 发明了PCR。 他原本是要 合成DNA引物来进行测序 工作， 却常为没有足够多 的模板DNA而烦恼。1983 年春夏之交的一个晚上， 他开车去乡下别墅的路上 萌发了用两个引物（而不 是一个引物）去扩增模板 DNA 的想法…...
DNA芯片技术的基本原理
DNA芯片技术的基本原理是分子识 别，与Southern杂交和Northern杂交 同出一理，即DNA的碱基互补配对和 序列互补原理。
DNA芯片的类别
据芯片的性能与用途分： 1）毛细管型微芯片 2）基因探针型微芯片 据DNA芯片上微排列的DNA不同分： 1）寡核苷酸芯片 2）cDNA芯片
检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋 白质转移到固相载体上，用特异的抗血 清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤：
蛋白质样品的制备
SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移：NC膜
靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应

DNA芯片技术流程
◆芯片方阵的构建
◆样品制备
◆生物分子反应
◆信号的检测及分析
DNA芯片应用
可在基因组水平进行基因表达和发现研究、
突变、序列测定等，已方泛应用于基因组研究 和人类疾病的诊断等多领域。
Hom
e
(3) 芯片实验室(Lab-on-a-chip)
基因芯片

基因芯片：是指将大量探针分子固定在物体表面， 与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分 子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和系 列信息。 它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因 组信息而显示巨大威力。 目前，基因芯片已经应用于基因表达检测、寻找新 基因、杂交测序、基因突变等许多方面。

Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA 重组技术一样意义深远
Good idea +work hard +publish=Success