免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）免疫组化步骤：1.将脑片放到，6 孔板（或12 孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS 洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；2.吸去双氧水，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4.然后，4℃，过夜（18h 或者24h），不建议使用37℃；5.然后，PBS 洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。

6.DAB 配方为：10mg DAB 固体加到20ml 0.01MPBS，临用时加100-200 微升30%双氧水，注意避光。

7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。

一般3 分钟显色就比较明显，如果20 分钟仍未显色，则看下面的参考。

8.然后PBS 洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。

干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。

9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。

如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。

免疫荧光步骤及注意事项：1， 将脑片放到 6 空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS 洗一遍）2， 吸去山羊血清，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3， 然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS 稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4， 4℃，过夜（18h 或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48 或72 小时；5， 然后，PBS 洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。

注意避光操作。

6， 0.01M PBS 洗两遍，转移到载玻片上，避光自然晾干；7， 滴加防淬灭剂后，盖上盖玻片镜下观察。

常见问题：1， 荧光太暗：可能蛋白表达少；可能一抗孵育时间短；二抗孵育时间短；清洗次数过多；溶液pH 不合适；荧光萃灭；一抗浓度过低或过高；二抗浓度过低或过高；激发波长不在抗体适用波段。

2， 背景荧光太深：一抗浓度过高，清洗不彻底；二抗浓度过高，清洗不彻底；封闭时间过短，非特异性过强；一抗非特异性过强；二抗非特异性过强；显微镜荧光强度过强。

总之实验是喜欢强阳性，不喜欢假阴性，呵呵。

任何实验都需要花时间摸索才能找到其最佳的工作条件。

另附免疫组化常见问题解析。

原理是相同的，只是最后的显色方法不一样，有些问题有启发作用。

免疫组织化学1. 边缘效应?原因: 1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试 剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES 或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4 微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。

2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。

解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。

用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

2. 产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？1. 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。

解决办法: 这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。

这是最重要的一条。

2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。

3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5. DAB 孵育时间过长或浓度过高；6. PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP 孵育之后的浸洗尤为重要；7. 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

3. 免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。

不知抗体是进口的还是国产的工作液，怎么这么高稀释度也没能做出阳性结果？另外不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。

2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合;建议微波修复用高火4 次*6min 试试。

有人做过实验，这是最佳的时间和次数。

若不行，还可高压修复。

3、组织切片本身这种抗原含量低；4、血清封闭时间过长。

5、DAB 孵育时间过短。

6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。

7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

4. 背景强的原因?1, 考虑一抗浓度高；2,然后调整DAB 孵育时间；3,也要考虑血清封闭时间是否过短4,适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。

5. DAB 显色真的需要3-10 分钟吗？我之前做的显色40 秒就够了，再多本底就太深，现在做另一个显色3 分钟也不出，真的有必要延长显色时间吗？1. DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；2. DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；3. 此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；4. DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4 度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

6 . 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？，1 烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度二，用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做三，有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲 PBS 不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织，四，用高温修复时，温度骤冷也可能引起。

7. 年前爬的细胞片在-20 度放了半年（保鲜膜密封），现在取出来再作，做了两次，步骤均是按以前的作的，但今天做时，原来显色很强的片子现在显色很弱了，问什么呢？是不是片子放的时间太长了？抗体在 4 度放的时间也不长而且这次浓度比以前做的还高?1. 首先，抗体浓度和孵育时间在免疫组化中至关重要。

在抗原抗体反应并非抗体浓度越高，反应越强烈，这叫前带现象。

所以选择最佳的一抗浓度和孵育条件也是十分重要的，其实抗体浓度过高或过低均会引起阴性。

2. 我到认为你这片子的影响可能更大。

尽管在-20 度保存，但是时间一般超过3 个月就不能保证其中抗原的丢失，建议可以重新爬片，以排除方法和抗原的原因。

3. 你说抗体放在4 度保存是指未稀释还是稀释后抗体，存放多长时间？一般稀释后抗体不能保存很长时间的。

8. 为什么切片倾斜，抗体分布不均匀，就会造成一半阳性，一半阴性？我认为，即使切片倾斜，抗体覆盖少的那部分组织和其他部分抗体的浓度是一样的，只是抗体体积的大小差异！如果说抗体倾斜没覆盖好的地方是阴性，那为什么不是干片所导致的非特异性高背景的染色呢？当切片倾斜到有一半甚至都没液体时，就会出现阴阳脸样的着色。

你认为呢？9. 高温抗原修复后就没必要灭火内源性过氧化物酶?经过高温POD 已经灭活了，不错POD 是被被灭活了，但它仍有还原能力，仍能跟DAB发生氧化还原反应，使DAB 显色，我们用双氧水是耗竭POD 的还原能力，使之不能在跟DAB 反应。

所以无论修复与否都应该灭活POD，尽可能消除非特异性着色。

10. 冰冻切片有时会有小洞?冰冻切片有时会发现切片上会有空洞，这是因为组织在冰冻过程中形成冰晶，形成冰晶的原因一是组织冰冻时间太慢，或者冰冻的温度不够低，慢慢形成冰晶，二是有些组织在冰冻之前需要做适当的固定，如脑组织，然后放入30%的蔗糖4 度冰箱过夜以减少冰晶形成，并且能最大程度保持组织细胞形态。

另外在切片是组织块复温要在37 度速融，否则易造成组织块的破坏。

11. 常用免疫组化结果分析方法?1. 阳性着色细胞计数法。

在40*光镜下，随机选择不重叠的10 个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6 张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。

2. 灰密度分析法。

通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j 进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。

3. 评分法。

通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3 分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4 分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。

对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。

要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。

12. DAB 呈色后到底什么样染色是特异性染色？阳性标记可以从色度特征，阳性标记细胞学特征来进行基本的判断。

色度特征：一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。

根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱抗原；棕黄色，提示为中等度抗原；棕黑色，示为强抗原。

在结果判断中，后两者较有意义，可作为判断依据。

细胞学特征：阳性表达必须在细胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的阳性表达即使阳性也不应作为判断依据。

一般分为胞膜型，胞核型，胞质型，微绒毛型,复合型几种。

这是需要结合背景知识的。

同样，非特异性染色也有一定的特点：它首先是指抗原无明确定位，各种细胞累及一片，色度无深浅之分，这种标记组织片不能作为免疫组织标记结果判断的依据，造成非选民性染色的原因常为组织标本固定不佳，抗体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等。

因此，免疫组化特异性染色定位非常重要，一般情况下，阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深浅不一。

如果缺乏细胞音的不均一性染色，即或呈阳性染色，常提示为非特异性染色。

另外，组织片边缘反应和出血坏死灶周围阳笥反应不能作为诊断依据。

13. 1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？我用组织芯片和普通切片在多种条件下进行了抗原修复实验，发现在热修复后，组织脱片最主要原因是组织脱水不良，肿瘤组织黏附性差在小块组织时也容易撕脱（减小热修复加热功率，PBS 冲洗时不要直对组织冲洗、可以有效防范）。