文章编号：1001-764X（2011）08-575-03·临床检验技术研究·高分辨熔解技术常用荧光染料的SNP基因分型能力比较*尤崇革1，2，李晓军1，郜莉娜2，李菲菲2（1．南京军区南京总医院解放军临床检验医学研究所，南京210002；2．兰州大学第二医院中心实验室，兰州730030）摘要：目的评价LC Green、Syto9和Eva Green3种高分辨熔解（HRM）染料对单核苷酸多态性（SNP）基因分型的能力。

方法以肿瘤坏死因子（TNF）基因启动子-857C＞T（rs1799724）位点为例，分别用上述3种荧光染料进行PCR-HRM检测，依据特征熔解曲线进行基因分型并测序验证。

基因分型能力评价以野生型与纯合突变型PCR产物Tm值之差（△Tm）来表示。

结果PCR-HRM检测到4种特征熔解曲线，经测序后发现第4条为双突变杂合，包含-863C＞A（rs1800630）位点。

HRM染料LC Green，Syto9，EVa Green的基因分型能力分别为（0．52ʃ0．030）ħ、（0．51ʃ0．066）ħ和（0．39ʃ0．152）ħ。

其中Syto9野生型（CC）和突变型（TT）的变异系数（CV）均为0．03%，为3种染料中最低。

结论3种染料均能用于HRM技术进行SNP基因分型，Syto9和LC Green分辨率优于Eva Green，其中Syto9易用性最好、Eva Green性价比最高。

关键词：LC Green；Syto9；Eva Green；高分辨熔解技术；单核苷酸多态性中图分类号：Q75文献标志码：AComparison of common fluorescent dyes for SNP genotyping in HRM technologyYOU Chong-ge1，2，LI Xiao-jun1，Gao Li-na2，Li Fei-fei2（1．Institute of Clinical Laboratory Medicine，PLA，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Nanjing210002，Jiangsu；2．Central Laboratory，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou730030，Gansu，China）Abstract：Objective To evaluate the capability of three high-resolution melting（HRM）dyes including LC Green，Syto9and Eva Green applied in HRM technology for single nucleotide polymorphism（SNP）genotyping．Methods TNF promoter-857C＞T （rs1799724）was selected to evaluate the above three fluorescent dyes and their capabilities for SNP genotyping in HRM analysis were determined on the basis of the differences of Tm value of PCR products between wild type and homozygous mutant type．Results Four kinds of characteristic HRM curves were observed and the PCR products of the four melting curves were sequenced．The fourth melting curve was verified to be a dual-heterozygote which contained another SNP of TNF promoter-863C＞A（rs1800630）besides-857C＞T．The Tm value of resolution for SNP genotyping by LC Green，Syto9and Eva Green dyes were（0．52ʃ0．030）ħ，（0．51ʃ0．066）ħand（0．39ʃ0．152）ħrespectively．In the three HRM dyes，Syto9showed the lowest coefficients of variation0．03%in both wild-type and mutant type．Conclusion All the three fluorescent dyes can be applied to HRM technology for SNP genotyping．Syto9and LC Green are better than Eva Green in detecting resolution while Syto9is the best ease-of-use dye and Eva Green is the highest cost-effective dye．Key words：LC Green；Syto9；Eva Green；high resolution melting；single nucleotide polymorphism单核苷酸多态性（single nucleotide polymor-phisms，SNPs）作为第三代遗传标记被广泛用于疾病基因组学和药物基因组学以及分子诊断研究。

尽管作为经典技术的PCR-RFLP（polymerase chain reac-tion-restriction fragment of length polymorphism）和荧光标记探针法常被用于SNP分型，但前者的操作繁琐、易污染、灵敏度低和后者的成本昂贵使全基因组关联分析（genome-wide association studies，GWAS）的后续病例-对照研究工作困难重重。

2003年Wittwer 等［1］首次报道了用新型饱和荧光染料LC Green进行基因分型的高分辨熔解技术（high resolution melt-ing，HRM）；随后HRM功能qPCR仪（如rotor-gene 6000）也开发成功，加之新型荧光染料Syto9和Eva Green的出现使HRM技术成为基因突变筛查的新秀［2］。

然而这些染料基本都是商品化的Master Mix，影响因素较多。

本研究以自制PCR-HRM反应体系评价这3种荧光染料的SNP基因分型能力及其影响因素。

*基金项目：中国博士后科学基金资助项目（20080430239）。

作者简介：尤崇革，1968年生，男，主任技师，博士，研究方向为基因组学与分子诊断。

通信作者：李晓军，主任技师，E-mail：lixiaojun62@yahoo．com．cn。

1材料与方法1．1标本来源收集来自兰州大学第二医院中心实验室－40ħ保存的类风湿关节炎（rheumatoid ar-thritis，RA）患者全血样本（枸橼酸钠抗凝）100份，其中女性80例，男性20例，年龄12 76岁，均为临床确诊的RA住院患者。

1．2主要试剂与仪器全血基因组DNA提取试剂盒和QuickGene-Mini80核酸提取仪（日本Fujifilm公司），Eva Green染料（美国Biotium公司），Syto9染料和Platinum Taq DNA聚合酶（美国Invitrogen公司），LC Green染料（美国Idaho公司）。

Rotor-Gene 6000PCR仪（澳大利亚Corbett Research公司），Nano-drop2000微量蛋白核酸检测仪（美国Thermal scientific 公司），2F-258全自动凝胶成像系统（上海嘉鹏公司）。

1．3基因组DNA提取用QuickGene试剂盒柱提法提取。

取全血标本200μL，用裂解液裂解红细胞、白细胞后，经与其配套的QuickGene-Mini80核酸提取仪提取，通过正压使DNA与柱滤膜吸附，洗液洗涤3次后用200μL洗脱液洗脱基因组DNA，并分装于－40ħ保存。

用Nanodrop微量蛋白核酸检测仪进行浓度和纯度检测，3g/L琼脂糖凝胶电泳检测核酸完整性，PCR扩增鉴定其模板有效性。

1．4引物设计与合成以TNF基因启动子-857C ＞T（rs1799724）SNP位点为例，通过Pubmed-SNP 检索到其侧翼序列，用在线软件Primer3（http：// frodo．wi．mit．edu/primer3）进行引物设计。

上游：5'-AGACCTCTGGGGAGATGTGA-3'，下游：5'-CGTC CCCTGTATTCCATACC-3'，扩增片段长度为159bp；通过UCSC-PCR（http：//genome．ucsc．edu）验证其特异性后由南京金斯特公司合成，引物浓度调整到20μmol/L，于－40ħ保存。

1．5PCR-HRM检测反应总体系为15μL，包括30ng模板基因组DNA1μL，10ˑPCR buffer1．5μL，Platinum Taq DNA聚合酶（5U/μL）0．05μL，10mmol/L dNTP0．3μL，10μmol/L上、下游引物各0．45μL，1ˑLC Green/Syto9/Eva Green各1．5μL，1．5μL的MgCl2（其相应浓度分别为25/15/25 mmol/L），加灭菌重蒸馏水至15μL。

扩增条件：95ħ预变性2min，94ħ10s，60ħ30s，共40个循环；随后进行HRM分析，参数为96ħ30s，50ħ30s。

熔解曲线数据收集从83ħ到90ħ，温度上升率为0．05ħ/s。

依据熔解曲线峰型改变进行基因分型，各型选取2例送上海生工公司测序验证。

1．6基因分型能力评价3种HRM荧光染料的基因分型能力以野生型与纯合突变型PCR产物熔解曲线的熔解温度（Tm）值之差（△Tm）表示，△Tm数值越大则突变型与野生型熔解曲线峰差异越明显，基因分型越容易；其变异系数（CV）越小则同型样本熔解曲线峰的漂移越小，标准化曲线拟合越均一，软件自动分型率越高。

检测经测序验证的TNF启动子双SNP位点4种基因型标本（批内重复12次）并基因分型，记录每条熔解曲线的Tm值。