缺点
SSH技术对其实材料要求多
SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不再是全场cDNA 所研究材料的差异不能太大
差异显示技术(differential display,DD)
差异显示(differential display,DD)是1992年由美 国波斯顿Dena-Faber 癌症研究所的Liang Peng 博士 和Arthur Pardee 博士建立的筛选基因差异表达的有 效方法。是将mRNA反转录技术和PCR技术二者结 合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，因此也称为 DDRT-PCR。每一种细胞组织（同一组织细胞经不 同的处理）都有其特异表达的不同于其他组织细胞 的基因普，即特异的RNA指纹图谱。
Rsa I 酶切
cDNA 末端接头连接
E
实验流程
由RNA合成 cDNA
Rsa I 酶切
A, B, C, D cDNA 末端接头连接
E
末端补齐 第一次消减杂交 第二次消减杂交 末端补齐 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 E E 富集差异表达基因
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A B C
D
实验流程
由RNA合成 cDNA A B C D 第一次消减杂交
差减杂交技术原理
差减杂交（SH）具有富集作用，有利于克隆 低丰度基因esentationaldifferenec analysis, RDA)
抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization SSH)
Driver cDNA （过量）
Tester cDNA with Adaptor 2R
A B C D
ห้องสมุดไป่ตู้
A
B
C D
实验流程
由RNA合成 cDNA Tester杂交液 （Adaptor 1） A B C 第一次消减杂交 D 第二次消减杂交 末端补齐 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 富集差异表达基因 A, B, C, D D A B C Tester杂交液 （Adaptor 2R） Driver cDNA （加热变性）
Rsa I 酶切
cDNA 末端接头连接
E E
第二次消减杂交 加入共用PCR引物 末端补齐 A, D: 不能被扩增 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 富集差异表达基因 C: 线性扩增 B: 扩增受到抑制
EE
5’ 3’
3’ 5’
实验流程
由RNA合成 cDNA
Rsa I 酶切
cDNA 末端接头连接
EE
真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡， 到组织的分化、凋亡以及细胞对各种生物、理化因子的 应答，本质上都涉及基因的选择性表达。高等生物大约 有30 000个不同的基因，但在生物体内任意细胞中只有 10%的基因得以表达，而这些基因的表达是按时间和空 间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异 表达。其包括新出现的基因表达与表达量有差异的基因 表达。生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差 异表达引起的。由于基因差异表达的变化是调控细胞生 命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生 理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为 分析生命活动过程提供重要信息。
基本步骤：
首先提取待测组和对照组样品的mRNA，合成双 链cDNA；用DpnⅡ酶切两组双链cDNA进行消化。两 端接上单链接头1，补平后，用含接头1序列的引物 PCR扩增，再用DpnⅡ去除双链cDNA两端的接头1； 只给予待测组双链cDNA两端再接上单链接头2。将 待测组与对照组cDNA杂交，杂交反应体系中只有待 测组自身杂交形成的双链cDNA才两端都带接头2， 补平，用含有含有接头2序列的引物PCR扩增，待测 样品中特有的DNA序列两条链含接头2，因此成指数 增长，而只有一端带接头2的杂交体只能被线性扩增。 将此杂交产物再进行第二轮酶切、加接头、杂交和 PCR扩增，重复两次后，可确保从实验组中彻底去除 与对照组共有的序列。
5’ 3’
3’ 5’
加入巢式PCR引物 第一次消减杂交 第二次消减杂交 末端补齐 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 富集差异表达基因
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非特异性表达基因得到极大的扣除， 高效地富集了差异表达基因。
SSH 是目前为止较为简单有效的寻找差 异基因的方法, 其主要优点:





①灵敏度高 ; 一般说来 , 经过 SSH, 稀有丰度的 cDNA 能富集 1000 倍~5000 倍, 这种富集作用使得低至每细胞一个拷贝的分 子也有可能被检出; ②提高了基因克隆的效率 ; 由于使用 4 碱基内切酶使得基因 ( 组) 的复杂程度降低, 大大提高了信息量, 在一次SSH 试验中 可同时分离出上百个差别表达的基因; ③假阳性率低; ④操作简单, 速度快, 效率高;一次SSH 可以同时分离到几十甚 至几百个差异表库。

早期，从mRNA转录水平筛选差异表达基因的方法是差别筛选技 术和差减杂交法，但二者存在灵敏度低、工作量大、周期长及 步骤繁琐的问题。

哈佛大学医学院 Liang 和 Struss 博士发明了mRNA 差异显示技 术，即DDRT—PCR(differ—ential display of mRNA by PCR)。

抑制 PCR 是利用链内复性优 先于链间复性的原理，使非目 标序列片段两端的长反向重复 序列在复性时产生“锅柄样” 结构或“发夹结构”而无法于 引物配对，从而选择性的抑制 非目标序列的扩增。
抑制性消减杂交—原理
杂交动力学
不同丰度的单链DNA得到均衡
抑制性PCR
目的基因得到富集
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杂交动力学
抑制差减杂交技术运用了杂交二级动 力学原理,即高丰度的单链cDNA在退 火时产生同源杂交的速度快于低丰度 的单链cDNA,在试验组(tester)和驱动 组(driver)的cDNA变性后再复性的过 程中,原来在丰度上有差别的单链 cDNA达到均一化。
1994年，Erric Haay等将这种方法正式命名为差异显示反转录 聚合酶链式反应 (mRNA Differential Display PCR) ，简称 DDRT—PCR
mRNA差异显示技术的原理：
mRNA差异显示技术的主要原理是利用cDNA反转录技术,PCR 扩增和高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，来显示PCR产物 的差异。其中，反转录技术中使用了一系列能与mRNA的Poly （A）尾巴相结合的锚定寡聚脱氧核苷酸引物oligoT12MN。 锚定引物与 mRNA 的Poly（ A） + 的两个碱基，在反转录酶的 作用下可以启动mRNA群体反转录。
酶降解差减杂交(enzymaticdegradingsubtraction, EDS)
接头捕获差减杂交(linker capture subtraction LCS)
代表性差异分析(representational difference analysis, RDA) 代表性差异分析（RDA）用于筛选两个样本中 基因组DNA之间的差异基因片段。在此基础上又发 展为cDNA-RDA技术，用于筛选差别表达基因。 基本原理： 其原理是将差减杂交与PCR 结合, 根据以双链 DNA 为模板进行PCR 扩增时产物呈指数扩增, 而以 单链DNA 为模板则呈线性扩增的原理, 首先提取待测 组和对照组的总RNA 或mRNA, 反转录成cDNA, 用识 别4 个碱基的内切酶(如Dpn Ⅱ)充分消化, 然后进行 PCR, 使两组cDNA片段得以富集, 接着连续进行若干 次差减杂交, 去除共有基因。最后利用PCR技术富集 实验组特异表达基因的cDNA片段。
研究基因差异表达的主要技术有 差别杂交
(differential hybridization) ，扣除（消减）杂交
(Subtractive hybridization) ， mRNA差异显示技术 (mRNA differential display reverse transcription PCR,DDRT-PCR) ，抑制消减杂交法(suppressial substractive hybridization ,SSH) ， 代表性差异分
优势： （1）高效性，与传统的差减富集相比，更加敏感，可 以筛选出低拷贝的差异基因； （2）可靠性，结果重复性好，假阳性率非常低。有人曾
结合cDNA-RDA和膜杂交筛选，对比正常人口腔黏膜上皮和HPV 永生化的口腔上皮细胞系，获得了384个差异表达的克隆，并证 实其中含69种差异基因。
cDNA-RDA技术的局限性在于： （1）得到的差异片段是平均为300~600bp的小片段。 （2）由于cDNA较基因组DNA短，消化后可造成cDNA 序列两端信息量丢失。 （3）完全无酶切位点的片段无法参与RDA筛选。 （4）在极低拷贝差异基因的筛选上进行了改进，但仍 有不足。
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抑制性消减杂交—特点
采用两次消减杂交和两次PCR，保证了高特异性； 通过杂交操作，可以获得低丰度差异表达基因； 操作简便，实用有效，全过程仅需3 - 4天。



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实验流程
由RNA合成 cDNA
Rsa I 限制性内切酶酶切
cDNA 末端接头连接 第一次消减杂交 第二次消减杂交 末端补齐 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 富集差异表达基因
3‘
3‘ 5’
M N TTTTTTTTTTTT 5’ 不同长度的 dNTP、Taq聚合酶 延长 PCR产物 M N TTTTTTTTTTTT 5’ M’N’AAAAAAAAAAA 3’ 变性、退火、延伸 电泳 显示 回收差异条带，再扩增， 克隆测序，同源比对
析 (Represential display analysis ,RDA) ，交互扣
除RNA差别显示技术(RSDD) ，以及基因表达系列
分析和电子消减
差减杂交(subtractive hybridization,SH)