两台高压输液泵， 两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定 比例送入混合器，混合后进入色谱柱。 比例送入混合器，混合后进入色谱柱。
低压梯度(内梯度) 低压梯度(内梯度)
一台高压泵, 通过比例调节阀, 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。 极性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。
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第二节 主要分离类型
二、液-液分配与化学键合相色谱 液分配与化学键合相色谱
）、液 （一）、液-液分配色谱
与气相色 谱中气--液 谱中气 液 色谱比较？ 色谱比较？
固定相与流动相均为液体（互不相溶）。 固定相与流动相均为液体（互不相溶）。 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。 K不仅与固定相的种 不仅与固定相的种 类有关， 类有关，也与流动相 的种类有关。 的种类有关。
固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。 固定相 固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。 固体吸附剂 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 流动相 各种不同极性的一元或多元溶剂。 各种不同极性的一元或多元溶剂 分离机理：流动相中的溶质分子(X)与溶剂分子 分离机理 ： 流动相中的溶质分子 与溶剂分子 (S)在固体吸附剂上竞争吸附的结果。 在固体吸附剂上竞争吸附的结果。 在固体吸附剂上竞争吸附的结果
没食子酸
3,4-二羟基苯甲酸 二羟基苯甲酸
固定相: 非极性; 流动相: 极性 固定相 非极性 流动相 组分极性: 二羟基苯甲酸<没食子酸 组分极性 3,4-二羟基苯甲酸 没食子酸 二羟基苯甲酸
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第二节 主要分离类型
三、离子交换色谱
固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。 固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。 键合基团 担 体 苯乙烯-二 苯乙烯 二 乙烯苯共 聚物微球 键合 阳离子： 阳离子： －SO3H(强) 强 －CO2H(弱) 弱 阴离子： 阴离子： －N+R3(强) 强 －NH2 (弱) 弱
对多环芳烃 维生素B、黄曲霉素、 对多环芳烃，维生素 、黄曲霉素、卟啉类化合 农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。 物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。
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第一节 高效液相色谱仪
特点： 特点：
高灵敏度； 高灵敏度； 高选择性； 高选择性； 可用于梯度洗脱。 可用于梯度洗脱。
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第二节 主要分离类型
X M + nS S = X S + nS M
c( X s )[c(S M )] K= n c( X M )[c(S s )]
n
下标M、 分别代表流动相和固定相 分别代表流动相和固定相， 代表被吸附的 下标 、 s分别代表流动相和固定相 ， n代表被吸附的 溶剂分子数；K代表吸附平衡常数。 代表吸附平衡常数。 溶剂分子数； 代表吸附平衡常数
氨丙基 氰乙基、 氰乙基、醚和醇等 极性基团
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第二节 主要分离类型 键合色谱柱、 例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离 键合色谱柱 甲醇以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。 以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。
保留时间： 保留时间：
HO
COOH
COOH
<
OH OH
OH OH
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第二节 主要分离类型 1. 键合固定相制备 硅烷化反应
硅胶
十八烷基 氯硅烷
ODS(C18)键合相 键合相 非极性
使用pH范围： 使用 范围： 2-8 范围
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第二节 主要分离类型 2. 键合固定相类型
反相柱
类 型
正相柱
不同碳原子数的 烷烃（ 和 烷烃（C8和C18）、 ）、 苯基等疏水基团
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第一节 高效液相色谱仪
缺点： 缺点：
灵敏度低； 灵敏度低； 对温度敏感； 对温度敏感； 不能用于梯度洗脱。 不能用于梯度洗脱。
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第一节 高效液相色谱仪 ）、荧光检测器 专用型检测器 （三）、荧光检测器—专用型检测器 基本原理：在一定的条件下， 基本原理：在一定的条件下，荧光强度与流动 相中的组分的浓度成之比。 相中的组分的浓度成之比。
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第三节 液相色谱的固定相与流动相
一、固定相 二、流动相
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第三节 液相色谱的固定相与流动相
一、固定相 分配色谱固定相 液-固吸附色谱固定相 固吸附色谱固定相 固定相 离子交换色谱固定相 空间排阻色谱固定相 手性固定相
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第三节 液相色谱的固定相与流动相 ）、分配色谱固定相 （一）、分配色谱固定相 全多孔型固定相
试样组分与交换基 团间的作用力的大小决 定色谱的保留行为。 定色谱的保留行为。
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第二节 主要分离类型
阳离子交换： 阳离子交换：R—SO3H + M+ = R—SO3 M + H+ 阴离子交换： 阴离子交换：R—NR4OH + X- = R—NR4 X + OH组分与离子交换剂之间作用力的大小与离子半径、 组分与离子交换剂之间作用力的大小与离子半径、 离子半径 电荷、存在形式等有关。作用大，保留时间长。 电荷、存在形式等有关。作用大，保留时间长。 等有关 应用：离子及可离解的化合物， 应用：离子及可离解的化合物， 氨基酸、核酸、蛋白质等。 氨基酸、核酸、蛋白质等。
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第二节 主要分离类型 流动相： 流动相 阳离子交换树脂固定相，采用酸性水溶液； 阳离子交换树脂固定相，采用酸性水溶液； 阴离子交换树脂固定相，采用碱性水溶液。 阴离子交换树脂固定相，采用碱性水溶液。
基本原理： 基本原理： 试样组分在固定相上发生的反复离子交换反 应 ， 依据组分与离子交换剂之间亲和力的不同而 分离。 分离。
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改变流动相的组成来 改善分离效果。 改善分离效果。
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第二节 主要分离类型 固定相极性>流动相极性 固定相极性 流动相极性 正相分配色谱 （正相柱） 正相柱） 固定相极性<流动相极性 固定相极性 流动相极性 反相分配色谱 反相柱） （反相柱）
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组分极性越大， 组分极性越大，保留 时间越长； 时间越长；使用极性 化合物的分离。 化合物的分离。
组分极性越小， 组分极性越小，保留 时间越长；适用非极 时间越长； 性化合物的分离。 性化合物的分离。
第二节 主要分离类型 ）、化学键合固定相色谱 （二）、化学键合固定相色谱 将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 担体）表面的游离羟基上。 （担体）表面的游离羟基上。
特点
固定相非常稳定，在使用中不易流失。 固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于 可将各种极性的官能团键合到载体表面， 可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它 适用于种类繁多样品的分离。 适用于种类繁多样品的分离。
多孔球体(氧化铝 、 硅藻土等) 多孔球体 氧化铝、 硅藻土等 氧化铝 +固定液 固定液 早期固定相 已不多见
分类
表面多孔型固定相
微珠担体(玻璃微球 固定液 微珠担体 玻璃微球) +固定液 玻璃微球
化学键合固定相
硅胶表面键合有机分子
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第三节 液相色谱的固定相与流动相 化学键合固定相 利用硅胶表面存在的硅羟基， 利用硅胶表面存在的硅羟基 ， 通过化学反应将 有机分子键合到硅胶表面。 有机分子键合到硅胶表面。 A. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C 硅氧碳键型： B. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： C. 硅碳键型： 硅碳键型： D. 硅氮键型： 硅氮键型：
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第一节 高效液相色谱仪
三、 梯度淋洗装置
在液相色谱中,可以通过改变流动相的组成、 在液相色谱中,可以通过改变流动相的组成、 极性来改善分离和调节出峰时间。 极性来改善分离和调节出峰时间。
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第一节 高效液相色谱仪
高压梯度(外梯度 高压梯度 外梯度) 外梯度
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第二节 主要分离类型 阳离子交换： 阳离子交换：R—SO3H + M+ = R—SO3 M + H+ 阴离子交换： 阴离子交换：R—NR4OH + X- = R—NR4 X + OH一般形式： 一般形式： R—A + B = R—B + A
KBA
仪器分析
c(R − B )c( A) = c(R − A)c(B )
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第一节 高效液相色谱仪
六、 液相色谱检测器
紫外检测器 示差折光检测器
类 型
荧光检测器 电化学检测器 电导检测器
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第一节 高效液相色谱仪 ）、紫外检测器 应用最广泛的检测器 （一）、紫外检测器—应用最广泛的检测器 基本原理： 基本原理：试样组分对特定波长的紫外光具有选择 性的吸收， 性的吸收，吸光度与试样组分浓度之间的定量关系 符合郎伯-比耳定律。 符合郎伯-比耳定律。 优点： 优点：
第四章 高效液相色谱分析法 第一节 高效液相色谱仪 第二节 主要分离类型 第三节 液相色谱的固定相与流动相 第四节 影响分离的因素与分离类型的选择
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第一节 高效液相色谱仪
一、 高效液相色谱仪结构流程
二、 高压输液系统 三、 梯度淋洗装置 四、 进样系统 五、 分离系统 六、 液相色谱检测器