（二）双功能酶（多功能酶）
目前研究发现，
β-半乳糖苷酶-半 乳糖脱氢酶融合蛋白在一定条件下， 其偶联反应产生 NADH 的速度是 同时加入这两种酶的反应速度的两 倍以上。同时过渡态时间缩短近四 倍。
（三）定向药物
定向药物一般由两部分组成：一部
分是药物；另一部分是可以与病灶 特异性结合的配基。通过融合蛋白 技术将这两部分融合在一起， 即 可构成一个具有独特构象与功能的 蛋白质。
（二）融合蛋白技术的内容
2.在载体中进行重组：通过限制 内切酶将两个DNA片段进行酶 切并回收，然后通过连接酶将 两个具有相同末端酶切位点的 基因片段进行体外连接，并克 隆到高表达质粒载体中，构建 重组质粒。
（二）融合蛋白技术的内容
3.将重组表达载体转染宿主细胞 并利用选择标志进行筛选及测 序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋 白的纯化 。
（一）融合蛋白技术的特点
真核表达系统的特点是蛋白翻
译后加工机会多，甚至可被改 造成人源型；真核细胞易被转 染，具有遗传稳定性和可重复 性；产物可被分泌，提纯简单， 成本低。
（二）融合蛋白技术的内容
构建融合蛋白的基本原则是， 将第一个 蛋白的终止密码子删除，再接上带有终 止密码子的第二个蛋白基因，以实现两 个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互 补原则 ，设计合适的引物序列，以 cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同 的目的DNA片段。
二、融合蛋白技术概况
融合蛋白技术是为获得大量 标准融合蛋白而进行的有目的 性的基因融合和蛋白表达方法。 利用融合蛋白技术，可构建和 表达具有多种功能的新型目的 蛋白。
（一）融合蛋白技术的特点
融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌)
也可在真核细胞中进行表达。原核表 达系统的特点是时程短，费用低，是 科研中的主要工具。其缺点是真核蛋 白表达没有得到确切修饰；大量蛋 白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物， 需要复杂的变性和复性过程；大量蛋 白的分泌较困难。
（一）DNA疫苗
目前，疫苗已经经历了三代： 第一代疫苗是用减毒或杀死的病原体来激 活机体免疫系统； 第二代疫苗是用生物技术和重组DNA技术 研制的组分疫苗注射机体诱导免疫应答； 第三代疫苗是直接注射基因重组的抗原基 因来激活人体免疫系统，即DNA疫苗。
（一）DNA疫苗
• DNA疫苗与传统疫苗相比有着 明显的优势，如易于生产，稳 定性强，成本低廉等，并可同 时诱导体液与细胞免疫应答。
（三）定向药物
特点：它可以特异性地与靶细胞或
致病因子结合，并把药物引导至病 灶处，从而大大提高药物的效力。 可以选择性地杀伤相应的抗原相关 细胞或受体相关细胞，对其他无关 细胞影响较少或无影响。
（三）定向药物
配基常是肿瘤特异性抗体、细
胞因子或激素等导向物质，药 物常是毒性

（三）融合蛋白技术的关键
遗憾的是，目前对于连接肽序列的设
计还没有可靠的选择标准。现在，大 多数连接肽序列的设计和选择仍主要 依赖于直觉。尽管依赖于蛋白质的一 级结构来预测其二级结构已经产生了 重大的进步，但是我们对于序列和结 构之间的关系的了解还是很有限的。
三、融合蛋白技术的临床 应用
DNA疫苗 双功能酶（多功能酶） 定向药物 溶栓剂 抗菌肽
（四）溶栓剂
新型溶栓剂的要求是具有多种功能，
既有较高的溶栓活性，又有较强的 纤维蛋白的亲和性或抑制血栓的功 能，从而使溶栓剂具有较高的纤维 蛋白专一性，减少出血副作用，降 低溶栓药物使用后再栓塞形成的可 能性。
（一）DNA疫苗
• DNA疫苗的免疫方法是将带 有目的基因并能在真核细胞 中表达的细菌质粒直接导入 动物体内，通过在体内表达 目的蛋白以引起机体对该蛋 白的免疫应答。
（一）DNA疫苗
• 目前利用基因工程成功制成的多价 重组抗体融合蛋白 CYF196(国内尚 未上市)就是一种DNA疫苗， 它能 有效防治下呼吸道感染和哮喘。因 为CYF196对病毒的主要受体-位于 呼吸道上皮中的细胞间黏附分子有 高度亲和力，对鼻病毒感染有较强 • 的防御功能。
融合蛋白及其应用
主要内容
融合蛋白的概念
融合蛋白技术概况
融合蛋白技术的临床应用 常见的几种融合蛋白
一、融合蛋白的概念
在基因工程迅速发展的基础上， 有目的地把两段或多段编码功能蛋白 的基因连接在一起，进而表达所需蛋 白，这种通过在人工条件下将两个或 多个基因的编码区首尾连接，由同一 调控序列控制构成的基因表达后所得 的蛋白质产物称为融合蛋白(fusion protein，FP)。
（三）融合蛋白技术的关键

在构建融合蛋白中，一个关键的问题 是两蛋白间的接头序列( Linker )，即 连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和 稳定性非常重要。如果接头序列太短， 可能影响两蛋白高级结构的折叠，从 而相互干扰；如果接头序列太长，又 涉及免疫原性的问题，因为接头序列 本身就是新的抗原。
（三）融合蛋白技术的关键

一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的 要求。 有人尝试在融合蛋白间加入一 段有疏水性和一定伸展性的较长肽链， 如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开， 以缓解相互干扰作用， 并获得了满意 的结果。
（三）融合蛋白技术的关键
但具体涉及到每种蛋白时，需具体分 析。当我们构建融合蛋白时，应多选 择几种融合方式， 从中优化出理想的 连接方式。 另外，大量研究表明连接肽的柔性和 疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域 是十分重要的。
（二）双功能酶（多功能酶）
以往研究发现 ， 在利用基因 融合所构建的大的酶分子中，如果 用以构成融合蛋白的各个酶分子的 整个编码序列均保留于新的酶分子 中，则融合蛋白一般均保留所构成 的酶分子各自的酶活性。
（二）双功能酶（多功能酶）
并且发现在这些新构建的融合蛋 白中，蛋白的正确折叠以及各个酶 的活性部位均未受到影响，与单个 酶相比，融合蛋白的酶的比活力为 50%-100%，对于催化连续反应的 两种或几种酶， 利用基因融合的方 法构成的融合蛋白可产生“ 邻近效 应” （proximity effect）。