观察与检查：妊娠零天（判定方法）开始，记录实
验动物症状、体重（0、3、7、10、16、20d）； 20天处死，记录孕鼠重、黄体数、死胎数、（着 床数、吸收胎、早期死胎、晚期死胎）、活胎数、 活胎重、外观异常等；一半胎鼠用Bouin氏液固 定做内脏检查，一半茜素红染色做骨骼畸形检查。
报告：将以上数据整理成表，并计算各种
• 繁殖试验流程图： • 见附页
• 结果评价： • 1、交配至分娩数据反映母体毒性和胚胎毒性 • 2、出生至断乳数据反映乳母感受性和仔鼠生长 发育 • 3、断乳至性成熟数据提示早期效应的持续性和 对未成年个体的直接效应 • 4 F0和F1代数据的比较反映受试物对亲代生殖 细胞和激素系统影响
• 二、环境流行病学研究 • 可采用前瞻性队列研究以及回顾性或横断面研究 • 研究内容包括： • 问卷调查 • 检查及化验：生殖功能、临床检验如精液、 激素、分子生物学 • 化学毒物污染的检测 • 生物标记物检测
• 对照：阴性（溶剂）对照，也可设阳性对照
• 观察与报告：观察动物一般状况，记录胎仔数、 一般发育状况和外观畸形等。取一定数量幼仔配 对饲养，继续观察其存活、生长发育，包括行为、 生殖功能及其它异常症状，必要时可队F1代动物 进行运动和学习能力的测定等。 • 根据上述资料的统计分析结果结合病理组织 学检查，对围产期给药的毒性及程度做出综合评 价
一般生殖毒性试验 致畸试验 围产期毒性试验 繁殖实验 •
‘
• （一）一般生殖毒性试验 • 目的：评价化学毒物对生殖细胞（雌、雄）、 胚胎、胎儿的影响 • （以下引自新药临床前研究指导原则汇编— —药学、药理学、毒理学） • 动物：多用大鼠，雌、雄各20只 • 如必要可用家兔，避孕药还需用猴子试验。 • 剂量与给药途径：根据亚急性毒性试验结果 和毒代动力学试验数据设定 • 至少两个剂量组，高剂量组可产生轻微毒性 反应，给药途径原则上与临床拟用途径同。
• 分析：中性红染色判断细胞存活率 • 其他染色检测细胞分化程度。 • 3、生精细胞与间质细胞共培养 • 4 人胚胎干细胞
• 动物也可用小鼠或家兔
• 剂量分组：一般设四个组，一个空白对照，三个 实验组，必要时设阳性对照。 • 可采用1/4、1/16、1/64LD50或以亚急性毒性试验 的最大无作用剂量为最高剂量组，其1/30左右为 低剂量组，在中间设一组。 • 剂量设定原则：高剂量组应有母体毒性，如摄 食量减少、体重增长缓慢或下降，阴道流血、流 产等。药物可用最大给药量，但限制剂量为 1g/Kg。低剂量应无母体毒性和胚胎反应。
• （三）围产期毒性实验 • 目的：评价化学物于孕后期至断乳期之间对孕鼠 /哺乳鼠和胎儿/新生仔的潜在不良影响
• 动物：通常用小鼠、大鼠或家兔，每组孕鼠1520只，家兔8-12只 • 剂量与给药途径：与一般生殖毒性试验同
给药时间：大、小鼠于妊娠第15天开始给药，至 分娩后21天（小鼠）和28天（大鼠），家兔于妊 娠后22天开始给药，至分娩后31天。
• 给药途径：药物拟用给药途径或灌胃、自由摄取， 但不宜用腹腔注射。 • 给药时间：于胚胎器官形成期连续给药。 • 大鼠：孕后6-15天 • 小鼠：孕后6-15天 • 家兔：孕后6-18天 • 对照：必须设溶剂对照，必要时设阳性对照。可 供选择的阳性对照物有敌枯双（0.5-1.0mg/kg体 重），五氯酚纳（30 mg/kg /体重）阿斯匹林 （250-300 mg/kg ）及维生素A(25 000-40 000IU) 等.
生殖毒性的评价方法
艾宝民
目的和意义： 1、评价化学物对亲代生殖系统和子代安全性 2、生殖毒性化学物的管理和中毒预防 3、优生优育 提高人口素质
• 生殖毒性评价需四方面资料 • 1、动物毒性试验
• 2、控制下的临床研究 3、环境流行病学资料 • 4 体外试验
• 一 动物试验
• • • • • • • 分为四个部分：
• 三、控制下的临床研究 • 如新药临床终试以确定对病人的安全性 • 对于化学毒物可选择暴露人群，特别是高危 /敏感人群 以及志愿者，如保健食品的人群试食。 • 但控制下的临床研究有一定局限性，只适用 于那些引起短期效应和能较快逆转的效应，不适 于那些主要引起慢性疾病的效应。
• 四、体外试验研究 • 1、大鼠全胚胎培养（whole embryo culture） • 取材：从孕9-10天大鼠子宫取出胚胎，去胎膜， 在含受试物的培养液中O2、CO2、N2环境下培养。 • 观察：胚胎发育情况，记录肢芽数量和长度、 卵黄囊直径、体节和体长等 • 评价：根据Brown量表平分。 • 2、胚胎细胞微团培养（micromass culture） • 用来评价细胞毒性和发育毒性 • 从孕11天的大鼠胚胎取不同部位的细胞微团 在含受试物的培养瓶中培养 5 天。
•
• 给药时间：交配前，雄 60—80 天，雌 14 天，连 续给药。雌动物交配后继续给药至多数器官形成 期。 • 大鼠器官形成期一般为：6-15d • 对照：阴性（溶剂）对照，也可设阳性对照 • 观察指标与报告：动物一般状况、体重变化、受 孕率、死胎数、活胎数、活胎重量、外观和内脏 及骨骼变化，必要时做组织学检查，统计处理， 结果综合分析
• （四）繁殖试验（reproduction studies） • 又称多代繁殖试验（multigeneration reproduction studies） • 目的：评价受试物对亲代生殖和后代发育与生殖 的影响，尤其那些人类长期或世代接触并可能在 体内累积的化学物。 • 优点：可同时分析化学物的生殖、母体及发育毒 性。 • 动物：大鼠，雌、雄各20只（或雄10只） • 剂量分组：设对照组、低剂量组（可按最大无作 用剂量的1/30或可能摄入量的100倍），高剂量 组（为最大耐受量或有胚胎毒性的阈剂量）
畸形率，骨骼还要分析骨化程度 判定：各项数据经统计处理后判定胚胎毒 性和致畸潜力。
• • 致畸指数= •
LD50 最小致畸剂量
• 用来评价致畸强度，10以下为不致畸，10-100为 致畸，100以上为强致畸
• 注意事项： • 1、该试验不能肯定或排除由于两性配子损伤所 引起的畸形和胚胎毒性 • 2、给药剂量、时间、途径、动物敏感性对实验 结果有明显影响 见图 • 3、阴性（溶剂）对照也会有个别畸形或/和变异 • 4 某些畸形或变异如多肋、短尾不影响后代存 活和健康；某些部位或器官的骨化迟缓，如胸骨、 脊椎骨、趾骨、枕骨，可在出生后赶上正常动物， 属于胚胎毒性而非畸形。 • 5、变异与畸形的内在联系
• （二）致畸试验 • 目的：预测环境有害物质对人体的胚胎毒性及致 畸性 • 原理：母体在受孕期间受到可通过胎盘屏障的某 种有害物质作用，影响胚胎的器官分化与发育， 导致结构和机能的缺陷，出现胎儿畸形。在受孕 动物的胚胎着床后，并已开始进入细胞及器官分 化期时投以受试物，可检出该物质对胎儿的致畸 作用。 • 动物：首选性成熟大鼠（Wistar 或S.D)，80—90 只，雌、雄各半，鼠龄 90—100d，体重雄180g, 雌150g

• 给药方式：加入饲料或饮水中，亲代、子代接受 相同的剂量、饲料、饮水。受试物占饲料的比例 不超过20%。 • 观察指标：一般健康状况、体重、进食量、死亡 情况、受孕率、妊娠率、出生存活率、哺乳存活 率（4d、21d）、产仔总数、宫重及平均仔重。
• 计算： • 受孕率（%）=怀孕动物数/交配雌性动物数 x100 • 妊娠率（%）=分娩活体的动物数/怀孕动物 数x100 • 出生存活率（%）=产后4d仔鼠存活数/出生 时活仔数x100 • 哺乳存活率（%）=21d断乳时仔鼠存活数/ 出生4d后仔鼠存活数x100