P21在肾小球系膜细胞的表达变化及意义△柳飞，唐万欣，黄颂敏*四川大学华西医院肾内科，四川 成都 610041摘 要：目的：探讨高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21表达的影响及其在糖尿病肾病（DN）发病机制中的作用。

方法：将培养的大鼠1097系膜细胞株分为8组：正常对照组，高糖组，甘露醇组，不同浓度胰岛素组，高糖加不同浓度胰岛素组。

用RT-PCR法检测各组系膜细胞P21mRNA表达。

流式细胞仪定量检测各组系膜细胞前向角度散射光（FSC）大小。

结果：正常对照组系膜细胞中P21mRNA有一定表达。

高糖组P21mRNA表达明显增加为正常对照组的3.89倍(p<0.01)；FSC为正常对照组的1.42倍(p<0.01)。

不同浓度胰岛素组系膜细胞P21mRNA表达及FSC大小随胰岛素浓度增加而增加，但无统计学意义（p>0.05）。

结论：(1) P21mRNA在正常肾小球系膜细胞有一定表达。

(2) 高糖刺激可使系膜细胞P21mRNA表达上调，且与渗透压无明显关系。

(3) P21mRNA表达上调可导致系膜细胞肥大，在糖尿病肾病发病机制中起重要作用。

关键词：糖尿病肾病 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21 细胞肥大糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是糠尿病主要的微血管并发症之一。

在西方发达国家，DN已成为终末期肾功衰（End-stage Renal Failure, ESRD）的首位病因。

在我国，随着糖尿病的逐渐增加，糖尿病肾病也呈上升趋势。

因此，深入研究DN的发病机制，制定更加有效的防治措施已成为肾脏病工作者面临的重要问题。

DN的发病机制尚未完全阐明，一般认为是多种因素共同作用的结果。

DN早期即出现肾小球高滤过以及肾小球肥大。

肾小球肥大可导致肾脏结构不可逆的变化，如肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终导致终末期肾功衰。

近年来的研究证实各种因素对细胞生长的影响最终发生在细胞周期水平[1]。

细胞周期调控依赖于一系列细胞周期调控蛋白。

其中，P21是目前已知的具最广泛活性的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。

P21的过度表达与许多细胞增殖抑制和肥大有关[2-4]。

有研究表明，糖尿病早期肾脏肥大至少部分与肾皮质P21蛋白表达增加有关[5]。

而系膜细胞肥大在早期肾小球肥大中起关键作用，这已在糖尿病患者和糖尿病大鼠动物模型研究中得到证实[6、7]。

P21在肾小球系膜细胞肥大中发挥什么作用，目前国内外研究甚少。

本研究采用半定量RT-PCR法，观察高糖刺激，不同浓度胰岛素作用下，鼠1097系膜细胞中P21mRNA的表达及其变化。

相应条件下，用流式细胞仪测量细胞前向角散射光大小，从而获得系膜细胞体积大小，从细胞分子水平探讨高糖、胰岛素干预下，P21在系膜细胞肥大-肾小球肥大的关系，为DN的防治寻求新的治疗靶。

1 材料和方法*通讯作者△教育部博士点基金资助项目，编号200206100781.1试剂： RPMI1640培养基由美国GIBCO公司提供，小牛血清由成都哈里生物有限公司提供，Trizol RNA提取液和Titan TM one tube RT-PCR试剂盒由大连宝生物有限公司提供。

1.2 细胞来源及分组大鼠1097系膜细胞株来源于中山医科大学附一院肾脏病临床研究重点实验室。

本实验所用细胞为 5-7代。

将系膜细胞分为8组：正常对照组，生理浓度胰岛素组（10-9M Ins），低浓度胰岛素组（10-8M Ins），高浓度胰岛素组（10-6M Ins），高糖组（30mM D-Glu），甘露醇组，高糖加生理浓度胰岛素组（30mMD-Glu+10-9M Ins），高糖加高浓度胰岛素组(30mM D-Glu+10-6M Ins)。

每组设3复孔。

1.3 细胞干预因素1.3.1铺板。

将系膜细胞用0.25%胰酶消化液消化，10%FCS1640培养液终止消化。

镜下计数细胞，配成1×105/ml细胞悬液，接种于6孔平底培养板，2m1/孔，细胞密度1×105/ml，置CO2培养箱中培养。

1.3.2同步。

培养24h，吸弃上清液，加入1640培养液，置CO2培养箱培养24h，使细胞同步于G0期。

1.3.3加干预因素。

吸弃六孔板中上清液，将培养的5-7代系膜细胞按前述实验分组分为8组加入干预因素，2ml/孔，作用72小时，每24小时换液一次。

1.4 细胞内总RNA提取干预因素作用72h后，吸弃6孔板中上清液，用PBS洗涤各组细胞。

每孔加入1ml TrizolRNA提取液，提取各组细胞RNA，用紫外分光光度计测260mm的紫外吸收值，重复测三次，根据OD260值计算RNA浓度。

1.5 逆转录一多聚酶链反应（RT-PCR）根据文献[7]合成P21和β-actin 寡核苷酸引物。

β-actin: 上游5′-AAC CGG GAG AAG ATG ACC CAG ATC ATG TTT-3′，下游5′-GTG AAG CTC GTT CTC TAC CGG CGT AGT AGC-3′。

用这对引物可扩增出长度为352 bP的β-actin cDNA片段。

P21: 上游5′-AGT ATG CCG TCG TCT GTT CG-3′，下游5′-GAG TGC AAG ACA GCG ACA AG-3′。

用这对引物可扩增出长度310bp的P21 cDNA片段。

用Titan TM one Tube RT-PCR试剂盒，按说明书进行操作，细胞总RNA反应量均为1ug，总反应体积为50ul。

反应条件：①cDNA的合成和预变性：50℃ 30分钟，94℃2分钟；②PCR扩增：94℃ 30秒，56℃1分钟，72℃1分钟，30次循环；③循环完毕，72℃延伸10分钟。

β-actin：同P21。

1.6 PCR产物的检测与分析，取5ul PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳40分钟，紫外灯下用凝胶成像系统成像，用图像分析处理系统进行辉度扫描，并以β-actin为内参照，作校正相对量分析。

数值以两者之积分吸光度的比值表示。

以对照组的比值作为标准1.0。

1.7流式细胞仪检测系膜细胞大小用流式细胞前向角散射光（forward scatter, FSC）平均强度表示细胞大小，在各组刺激因素持续作用72小时后，0.25%胰酶消化液消化，收集各组细胞，PBS洗两次，调节细胞浓度至1×109/L，取细胞悬液，送流式细胞室。

流式细胞仪下测系膜细胞前向角散射光平均强度。

FSC主要与细胞体积成正比，即细胞体积越大，FSC越强。

1.8 统计分析：各组数据以均数±标准差（x-±S）表示，采用SPSS11.0统计软件进行统计学分析。

各组数据间比较采用t检验进行分析， P<0.05为有统计学意义。

2 实验结果2.1高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞P21mRNA表达的影响表1Group n x-±S正常对照组 30.317±0.02110-9M Ins. 3 0.352±0.01710-8M Ins 3 0.411±0.02510-6M Ins 3 0.528±0.01630mM Glu 3 **1.264±0.0380.364±0.022甘露醇组 330mMGlu+10-6M Ins 3 **0.978±0.02230mMGlu+10-9M Ins 3 **1.199±0.031注：Ins-胰岛素 Glu-葡萄糖。

与正常对照组相比，**P<0.01。

由表1可知，正常对照组系膜细胞中P21mRNA有一定表达。

高糖可以明显增加P21mRNA 表达。

高糖组P21mRNA表达是正常对照组的3.89倍。

胰岛素对P21mRNA表达有上调作用，但无统计学意义。

图12.2流式细胞仪测高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞体积大小的影响 表2Group n FSC正常对照组 3 395±1210-9M Ins 3 380±2110-8M Ins 3 398±1710-6M Ins 3 402±1630mM D-Glu 3 **564±26甘露醇组 3 398±1130mM D-Glu+10-6M Ins 3 **482±1330mM D- Glu+10-9M Ins 3 **517±35注： Ins-胰岛素 Glu-葡萄糖。

与正常对照组比较，**P<0.01。

F SC-细胞前向角散射光。

由表2可见，高糖可以明显促进系膜细胞体积增大，不同胰岛素加入高糖后，系膜细胞体积也有增大，单纯胰岛素组对系膜细胞体积大小无明显影响。

图2正常对照组与高糖组流式细胞FSC 强度图FSC 强度细胞数目图3各种情况下β-actin的表达M ：标记1：正常对照组 2：10-9M 胰岛素 3：10-8M 胰岛素 4：10-6M 胰岛素5：30mMD-葡萄糖6甘露醇组(25mM甘露醇+5mM D葡萄糖) 730mMD-葡萄糖-6 83M 胰岛素图4各种情况下P 21mRNA的表达（RT-PCR ） ：+10M 胰岛素：0mMD +10-9-葡萄糖M ：标记1：正常对30mMD-葡萄糖6甘露醇组D葡萄糖)葡萄胰岛素：葡萄糖-99β-actin 肾病（DN ）是糖尿病主要的微血管并发症之一，也是西方发达国家终末期肾功衰（E 期肾小球肥大将启动后期肾小球硬化。

在这一进程中系膜期蛋白依赖性激酶抑制剂的增加关系密切。

P 21是目浓度胰岛素刺激下P 21M 1 2 3 4 5 6 7 8 9照组 2：10-9M 胰岛素 3：10-8M 胰岛素 4：10-6M 胰岛素5：-6(25mM甘露醇+5mM 7：30mMD-糖+10M 830mMD-+10M 胰岛素：3 讨 论糖尿病SRD ）的首位病因。

在我国，糖尿病肾病的发生也在逐年增多， 由于DN 的发病机制尚未完全阐明，因此对DN 的预防和治疗措施尚待进一步完善，寻求一种DN 防治新的治疗靶和药物理论具有重要的现实意义。

D N 早期即出现肾小球肥大，而早细胞肥大在早期小球肥大中起着重要作用。

各种因素对细胞生长的影响最终发生在细胞周期水平。

细胞周期受一系列细胞周期调控蛋白的调控。

其中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（Cyclin Kinase Inhibitor ）可以抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，从而阻止细胞周期由G 1期向S 基转换，G 1期过度延长。

由于G 1期时，细胞蛋白质和mRNA 合成增加，以准备DNA 复制，故G 1期过度延长势必造成细胞肥大。

研究表明DN 早期，肾小球肥大与细胞周前已知的具有最广泛活性的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。