生物工程技术姜黄素对酿酒酵母抗衰老性能影响学院（系）：生命科学学院专业：生物工程学生姓名：张馨予徐瑶学号： 20161102137 20161102131 指导教师：崔京春老师完成日期：2016年12月22日大连民族大学摘要：姜黄素衍生物对酵母抗衰老性能影响。
在分别添加0.5g/L 4 种外源抗氧化物质的条件下培养酿酒酵母，测定不同培养时期酵母形态，絮凝速率及抗氧化酶活性。
结果表明，四种姜黄素衍生物能不同程度地改善因酵母衰老而表现出的细胞变瘪和表面褶皱，并有效降低酵母絮凝速率，提高酵母胞内抗氧化酶活性，以减少胞内 O2-.含量。
四种姜黄素衍生物均能降低活性氧氧化损伤，增强酵母抗衰老能力。
腺嘌呤姜黄素衍生物增强酵母抗衰老能力较强，而鸟嘌呤姜黄素衍生物相对较弱。
关键词：酿酒酵母；姜黄素衍生物；抗衰老；抗氧化酶一．背景1.1抗氧化剂抗氧化剂是指具有还原性，可抑制启动自由基链反应，阻止自由基反应传播并终止自由基反应的一类化合物，主要包括多酚、黄酮类化合物等。
它们在机体不同的微环境和代谢调节中起到抗氧化作用，并以此广泛参与、介导机体代谢，细胞分裂，基因表达等过程，在生命活动中起着十分重要的桥梁作用。
姜黄素是一种相对分子量较低的多酚类化合物，是含有多种功能基团的独特抗氧化剂，其酚基团是清除活性氧自由基所必须的，而甲氧基的存在进一步增加其抗氧化活性。
姜黄素是一个自由基清除剂和氢供体,具有亲氧化剂和抗氧化剂的双重活性，是未来最具潜力的抗癌药物之一，但因其水不溶性限制了它的研究与应用，刘巨涛等人对其进行了衍生化修饰，大大改善了其水溶性。
1.2酿酒酵母1.2.1酿酒酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种常用的工业微生物生产菌，在其发酵生产中细胞衰老、絮凝、沉降，失去活力。
Harman提出的自由基学说认为，需氧生物体内不断产生超氧阴离子自由基(Super oxygen anion，O2-.)、羟基自由基、脂氧自由基等活性氧自由基，同时体内的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和过氧化物酶(peroxidase，POD)等抗氧化酶类不断地清除上述自由基，以免除机体活性氧损伤。
机体衰老时，清除自由基能力减弱，内源性自由基损伤生物分子，特别是 DNA、生物膜与蛋白质。
因此，抗氧化酶类活性及自由基水平对酵母生长及衰老有很大影响。
酵母作为研究真核生物的模式生物，其抗衰老研究可进一步为真核生物的抗癌、抗衰老研究提供一定的理论参考。
1.2.2酿酒酵母衰老模式及影响因素机体老化时，清除自由基能力下降，内源性自由基加重损伤生物分子。
因此，抗氧化酶类活性及自由基水平对酵母生长及老化有很大影响。
酵母中已确立的衰老模式有两种:复制型衰老和时序型衰老，分别用复制寿命和时序寿命衡量。
复制寿命定义为单个母细胞在其死亡前能进行有丝分裂的次数，可以用来模拟多细胞生物的细胞衰老，测定方法是用显微操作仪将酵母细胞所出的芽移走，计算母细胞在死亡之前的出芽次数; 时序寿命则表示一定数量不分裂的酵母细胞在其稳定期的存活时间，可以模拟有丝分裂后的细胞衰老，一般是通过单菌落数的统计来确定。
酿酒酵母复制衰老和时序衰老同样存在许多不同点。
比如两种衰老模型所用的培养基、细胞的表型、细胞的细胞骨架、细胞壁结构和代谢都不相同。
除此之外，两者的分子机制也有诸多差异。
物种最高寿期不同的决定因素，都认为基因是内在的决定因素，而有氧代谢所产生的氧自由基所造成的氧化应激是主要的外在因素。
因此，笔者在酿酒酵母发酵过程中分别添加四种姜黄素衍生物：腺嘌呤、鸟嘌呤、二氯腺嘌呤、2，6-二氨基腺嘌呤姜黄素衍生物。
发现它们可不同程度地提高酵母抗氧化能力，进而增强酵母抗衰老性能。
随着培养时间增加，醇母沉降逐渐加快。
酵母絮凝速度加快的因素可能是由于酵母在衰老过程中由于细胞壁權皱程度增加，导致了细胞间表面粘附力增强，从而促进了细胞的聚集引起絮凝速率加快，也有可能是由于菌体在衰老过程中胞内活性氧积累，脂质过氧化加剧，导致细胞或组织损伤，从而导致细胞絮凝速率加快。
所以酿酒酵母的衰老可以用絮凝速率来表达，即600nm处的吸光值。
二．实验材料与方法2.1实验材料2.1.1菌种酿酒酵母，大连民族大学微生物实验室提供。
2.1.2实验试剂试剂：Tris、牛血清白蛋白、腺嘌呤、鸟嘌呤、二氯腺嘌呤、2，6-二氨基腺嘌呤；以上试剂均为分析纯。
培养基：强化 YPD 培养基：6 %葡糖糖、2 %蛋白胨、1 %酵母浸粉；四种姜黄素衍生物分别经 0.22 μm 无菌滤膜除菌后添加到 YPD 发酵培养基中。
仪器与设备：高速冷冻离心机、冷冻干燥机紫外可见分光光度计、手持糖度计、立式高压蒸汽灭菌锅、全温落地式摇床。
2.2实验方法2.2.1培养基固体培养基：YPD固体培养基，高温灭菌20min；液体培养基：6%葡糖糖、2%蛋白胳、1%酵母浸粉，121℃灭菌20min2.2.2酵母细胞培养实验以斜面保藏的酵母经液体培养活化后，在对数生长期时按照5.0X104cfu ／mL的接种浓度分别接入到两种发酵培养基中，培养条件为28.5℃、160r／min。
定时取样检测OD值及残糖，当发酵残糖低于5.0k／L时，终止发酵。
2.2.3残糖含量测定利用手持糖度计，在每日固定时间测定发酵液的糖浓度并做好记录。
2.2.4醇母絮凝能力的测定取经无菌水洗涤2次的酵母菌体，用生理盐水稀释至1.0-3.0X104／mL，摇匀，分装，每管20mL，室温静置，每隔30min从管中取样3ml，检测其600nm 处吸光值。
悬浮细胞浓度以600nm处吸光度表示。
2.2.5抗氧化酶活性及 O2-含量的测定SOD 酶活性的测定：邻苯三酚自氧化法。
CAT 酶活性的测定：钼酸铵比色法。
POD 酶活性的测定：愈创木酚法。
O2-.含量的测定：羟胺氧化法。
三．实验结果与讨论3.1酿酒酵母的降糖能力及外加抗氧化物质浓度的确定已知酿酒酵母经12h进入对数期，24h进入稳定期，216h后到达发酵终点。
故本实验选取24h、72h、120h、168h、216h酵母为研究对象进行后续试验。
前期研究表明，在酿酒酵母培养过程中添加姜黄素衍生物，随姜黄素衍生物浓度升高，降糖速率有所加快，且浓度为0.5g/L时促进作用接近极限，故本研究选取添加腺嘌呤、鸟嘌呤、二氯腺嘌呤、2，6-二氨基腺嘌呤姜黄素衍生物浓度为0.5g/L。
为比较四种抗氧化物质对酵母的影响，确定腺嘌呤、鸟嘌呤、二氯腺嘌呤、2，6-二氨基腺嘌呤添加浓度同为 0.5 g/L。
在酿酒酵母培养过程中，分别添加 0.5 g/L 的腺嘌呤、鸟嘌呤、二氯腺嘌呤、2-6二氨基腺嘌呤，可见，此4种抗氧化物质对酿酒酵母的生长代谢具有一定的促进作用，且促进作用的大小依次为腺嘌呤＞鸟嘌呤＞二氯腺嘌呤＞2,6-二氨基腺嘌呤。
图1.酿酒酵母发酵过程中糖浓度和600nm处OD值变化曲线2.2酿酒酵母的细胞形态及絮凝能力酵母细胞培养过程中，在其培养初期细胞代谢稳定，分裂有序进行，培养24 h后其形态稳定，表面光滑无褶皱，而培养 216 h 后的细胞经多次分裂产生芽痕，表面粗糙且如被絮状物质包裹，细胞变大，影响细胞与外界环境进行物质交换，增强细胞表面的粘附力，使细胞絮凝、沉降，衰老。
而外加抗氧化物质培养酵母216h 后，细胞虽变瘪、表面出现明显褶皱，但细胞形态相对保持较为完好。
同时，由图2酵母絮凝曲线可知，外源抗氧化物质对酿酒酵母培养初期细胞的絮凝性影响较小，但随着培养时间的延长，姜黄素衍生物组的酵母细胞的絮凝速率比对照组降低了10%-20%。
故添加外源抗氧化物质对酵母细胞形态的维持有一定的积极作用，进而延缓酵母细胞的絮凝，从而改善酵母发酵能力，并且四种种抗氧化物质影响作用大小顺序为腺嘌呤＞鸟嘌呤＞二氯腺嘌呤＞2,6-二氨基腺嘌呤。
图2.外源抗氧化物质对不同培养时间酿酒酵母絮凝能力的影响四．实验总结在酿酒酵母培养过程中分别添加四种姜黄素衍生物，都能不同程度的提高酵母抗氧化活性，从而降低活性氧对细胞的氧化损伤，有效延缓细胞衰老。
结合絮凝曲线，四种物质对酵母细胞抗衰老作用影响大小顺序为腺嘌呤＞鸟嘌呤＞二氯腺嘌呤＞2,6-二氨基腺嘌呤本实验研究了不同培养时间糖代谢速率，絮凝速率，细胞形态变化。
以上研究表明，随着随培养时间増加，酵母糖代谢速率减慢，絮凝速率加快，细胞变大。
姜黄素衍生物的确能影响抗氧化酶类活性从而对酵母生长及老化有很大影响。
具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老活性的姜黄素作为未来最具潜力的抗癌药物之一，经衍生化修饰，在改善了其水溶性后仍具有较好的生物学活性，为拓展其应用研究奠定了基础。
附录实验记录第一天12月24号一.清洗11个摇瓶，烘干后放入高压蒸汽锅灭菌1.5h。
二.配置强化 YPD 培养基（6 %葡糖糖、2 %蛋白胨、1 %酵母浸粉）；强化YPD培养基配制方法：1．溶解25g Yeast Extract（酵母膏）,50g Peptone（蛋白胨）于1800ml 水中。
并高压 121度 20min。
2.在灭菌后培养基中，加入150ml 经膜过滤的150g葡萄糖，并用无菌水定容至2500ml。
（注：葡萄糖，yeast extract ,peptone溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。
葡萄糖可以过滤除菌。
）三. 在无菌操作台进行如下操作。
挑取单菌落接至两管含有强化YPD培养基试管，进行菌种活化。
培养条件：将含有20ml强化YPD培养基的试管放入摇床，将转速为160r/min,温度为28.5度。
培养时间:12月24号晚上9:40到12月25号12:40约15个小时左右。
四．在无菌操作台将培养基注入11个摇瓶，每瓶200ml培养基后封存。
第二天12月25号一.清洗摇瓶，烘干后放入高压蒸汽锅灭菌1.5h。
二．在无菌操作台中，将活化后菌种接入两瓶含有强化YPD培养基的三角瓶中扩培。
培养条件：将含有20ml强化YPD培养基的试管放入摇床，将转速为160r/min,温度为28.5度。
培养时间：12月25号1:00到12月26号12:00约23小时左右。
第三天12月26日一．在11瓶灭菌后的摇瓶中每瓶注入1ml菌液。
二．把10个姜黄素衍生物样品溶于1ml酒精后注入10个培养基中，剩余一瓶培养基作为对照组加入1ml酒精。
三．把11瓶菌液放入38.5度160r/min摇床中培养。
培养时间：12月26日1：30到12月27日1:30第四天-第十四天12月27日-1月5日一．测量OD值1. 一般测菌体密度的OD的波长范围是580nm-660nm，波长在紫外范围内才够测量2.如用水做空白，需要离心洗涤菌体；如用不接种的培养基做空白就不需要洗涤,不接种的培养基要和接种的同时培养,以求条件一致3.OD值最好控制在0.1-0.4内，在这个区间得到的值很可靠，最好不要超过1.0；如果大于2.0，要稀释后再测，OD太大时，分光光度计的灵敏度会显著降低4.测吸光值的整个实验过程中，要保持发酵液或菌体的稀释倍数一致，可保证整个实验点有可比性（吸光值与稀释倍数不一定成正比）；取值的时候要连续读数，重复3次的数最好。