·５３０··实验研究·激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用武美娜李新毅白玮郭芬祁金顺【摘要】目的探讨激光共聚焦扫描显微镜（ＬＣＳＭ）技术在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中的应用。
方法采用原代培养大鼠皮层神经元，用ＬＣＳＭ测定给ＫＣＩ前后细胞内钙离子浓度的动态变化。
结果培养神经元状态良好。
用ＬＣＳＭ准确、稳定、可靠地测出细胞内钙离子浓度的动态变化。
结论ＬＣＳＭ在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中具有明显优势。
【关键词】显微镜检查，共焦；细胞内钙离子浓度；皮层神经元ＵｓｅｏｆＩａｓｅｒｅｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｆｏｒｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｒａｔｃｏｒ－ｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓＷＵＭｅｉ－ｎａ＇，ＬＩＸｉｎ一蚋，ＢＡｌＷｅｉ，ＧＵＯＦｅｎ，ＱＩＪｉｎ－ｓｈｕｎ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔ）＇，Ｔａｉｙｕａｎ０３０００１．Ｃｈｉｎａ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｏｃｕｍｅｎｔｔｈｅｐｒｏｍｉｓｅｓｏｆｌａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＬＣＳＭ）ｉｎｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆｉｎｔｒａｅｅｌｌｕｌａｆｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（『Ｃａ邳）ｊｎｓｕｂｊｅｅｔｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｒｕｇａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＬＣＳＭｗａｓｕｓｅ（１ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｏｆｆＣａ２ｑｉｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｒｔｉｃａｌｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＫＣＩｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｇｒｏｗｔｈｓｔａｔｕｓ．Ａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｏｆｄｙｎａｍｉｃ『Ｃａ２＋］ｉｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇＩ￡ＳＭ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＬＣＳＭｔｅｃｈｎｉｑｕｅｍａｙｓｈｏｗｐｒｏｍｉｓｅｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｉｎｆＣａ２＋］ｉ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＣＯｌｌｆｏｃａｌ；ＩｎｔｒａｃｅＵｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ＣｏｒｔｉｅａｌＣａ２＋是细胞内最为重要的阳离子和第二信使之一。
它对于神经递质释放、神经元之间信息传递和神经元存活等都具有重要意义。
神经元细胞内游离Ｃａｚ＋浓度（［Ｃａ：＋３ｉ）异常升高是导致胞内钙稳态失调和细胞死亡的重要因素…，因而观察神经元［Ｃａ２＋］ｉ的变化是神经生理学研究中的一个重要内容。
然而。
目前采用的一些测定细胞内钙离子浓度的方法．如Ｃａ“活化的发光蛋白法、偶氮染料法、ｃａ：＋选择性微电极测定法、发射示踪法、核磁共振法、荧光标记法等各有优势，但同时也有不足之处【引。
激光共聚焦扫描显微镜（１ａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＬＣＳＭ）是２０世纪８０年代诞生的一种先进的细胞生物学分析仪器。
利用紫外光或可见光激基金项目：国家自然科学基金科学部主任基金资助项目（３０７４００９５）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（２００６０１１４００４）；山西省自然科学基金资助项目（２００６０１１０５）；山西省重点实验室开放基金资助项目（２００６０３０１２）作者单位：０３０００１太原，山西医科大学生理教研室（武美娜、郭芬、祁金顺）；山西医科大学第一医院神经内科（李新毅）；山西省肿瘤医院病理科（白玮）通讯作者：祁金顺发荧光探针，计算机进行图像处理。
可以对活细胞生理信号、离子含量如Ｃａ嗽度进行实时动态分析检测。
ＬＣＳＭ具有高灵敏度、高分辨率、高放大倍数的特点。
可进行定性、定量、定时、定位的分析测量，是近代生物医学技术最重要的发展之一。
因此，它已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学和遗传学等领域新一代强有力的研究工具［，，４｜。
ＬＣＳＭ的一个显著优点是可以对同一样品平面随时间进行连续扫描。
进而分析细胞结构或细胞内离子含量的动态变化。
对细胞内Ｃ矿的动态测定，要求仪器具有实时、连续测定的能力。
本文介绍使用ＬＣＳＭ在原代培养大鼠皮层神经元细胞内Ｃａ２＋浓度动态测定中的具体应用及其优势。
１材料和方法１．１大鼠皮层神经元的原代培养：取新生１～３ｄＷｉｓｔａｒ大鼠，无菌条件下分离大脑皮层，剪碎（＜ｌｉｎｌｎ，）。
以终浓度为０．０３２５％的胰蛋白酶消化（３７℃，５—１０ｍｉｎ），用含胎牛血清的培养基终止消化，火抛光的Ｐａｓｔｅｕｒ吸管轻轻吹打１０～２０次，静置沉淀３～５ｍｉｎ．取上液２００目筛网过滤后１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ．弃上清。
加含１５％胎牛血清的达氏修正依氏培养基（ＤＭＥＭ）完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞密度为ｌｘｌ０６／ｍ１．种植于预先用多聚赖氨酸液包被的３５ｍｍ培养皿中，在３７℃、饱和湿度并通有５％ＣＯ：的孵箱中培养。
２４ｈ后换液移除碎片，４８ｈ后加入１０Ｉ山ｍｏｌ／Ｌ的阿糖胞苷以抑制非神经元细胞的增殖。
以后每周２次进行半量换液。
１．２荧光标记：实验当天，取镜下状态良好的细胞．以生理盐溶液（ＮａＣＩ１３０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＣＩ５．４ｍｍｏｌ／Ｌ。
ＣａＣｌ２１．８ｍｍｏｌ／Ｌ，ＭｇＣｌ２ｌｍｒｎｏｌ／Ｌ，葡萄糖２５ｍｍｏｌ／Ｌ，４羟基乙基哌嗪乙磺酸（ＨＥＰＥＳ）１０ｍｍｏｌ／Ｌ，用ＮａＯＨ调ｐＨ值为７．４）冲洗３次，换掉培养基，以荧光染料负载。
目前最常用的荧光染料为ｆｌｕｏ一３，其激发波长和发射波长分别为４８８ｎｍ和５２６ｎｍ。
该染料具有荧光选择性强、自身无荧光，只有进入细胞内与游离钙结合后才发出荧光。
不需紫外光激发等特点，因而能有效避免非特异性染色，避免紫外光对活细胞样品的损伤，具有细胞损伤小、敏感性高、不易淬灭、测量不易受干扰等优点。
通常ｆｌｕｏ一３的母液浓度为ｌ～５ｍｍｏｌ／Ｌ，以二甲基哑砜（ＤＭＳＯ）溶解。
一２０℃保存。
实验当天以生理盐溶液稀释至终浓度为１—５斗ｍｏｌ／Ｌ，负载条件为２０—３７℃、１５～６０ｍｉｎ。
在本实验条件下使用４Ｉｘｍｏｌ／Ｌｆｌｕｏ一３３７℃下负载５０ｍｉｎ。
为促进ｆｌｕｏ一３溶解和细胞内负载，可同时加入２０％的ｐｌｕｒｏｎｉｃＦ一１２７促进ｆｌｕｏ一３进入细胞。
ｌ－３神经元［Ｃａ２＋］ｉ测定：负载结束后，用生理盐溶液洗去细胞外多余染液，根据实验要求不同，加入一定量的生理盐溶液。
将培养皿置于共聚焦显微镜（ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ５）载物台上，选择镜下细胞分布均匀、染色良好的视野。
本实验使用ｆｌｕｏ一３染色，其激发波长和发射波长分别为４８８ｎｍ和５２６ｎｍ。
设定基础荧光强度值，观察基线一段时间后，加入药物，共观察２４０Ｓ，获得连续［Ｃａ２＋］ｉ的动态变化。
１．４后期分析处理：实验结束后，使用Ｌｅｉｃａ自带分析软件进行分析处理。
此时可手工选定细胞．并可同时对多个细胞进行分析处理。
实验结果可以实时获得，包括每个时间点的静态图片、整个实验中细胞内荧光强度的连续动态记录（动画显示和动态时间曲线），还可以在处理后方便地得到每一时间点的灰度值并转为Ｅｘｃｅｌ数据。
进行后期处理。
可对实验结果进行定性或定量分析。
定性分析根据Ｌｅｉｃａ自带分析处理软件给出的动态曲线可以直接观察给药前后［ｃａｚ＋］ｉ的变化。
·５３１·而定量分析则需对每一时间点的灰度值进行统计学的分析处理，可以直接使用仪器所测荧光强度或用给药前后荧光强度的比值，即相对荧光强度，观察给药前后［Ｃａｚ＋］ｉ的变化及给予不同药物后［Ｃａ２＋］ｉ的差别。
１．５统计学处理：每组实验重复３次，每次设平行皿２个。
所有结果以互蜘表示，组间差异采用ｔ检验．以Ｐ＜０．０５差异有统计学意义。
２结果２．１用于Ｃａ２＋成像实验的原代培养细胞：根据实验目的不同，可选择不同培养天数的细胞进行实验。
在相差倒置显微镜下观察．神经元在接种后６ｈ大部分已贴壁．并开始有短的突起长出：２４ｈ后突起延伸变长，胞体完整，表面光洁，边缘清晰，立体感明显，折光性强，四周光晕良好：３～５ｄ后神经元突起间已形成突触联系和神经元网络。
随着培养时间的延长，神经元胞体逐渐变大。
网络更加发达：ｌ周后可看到明显的细胞核及核仁。
在该培养条件下。
神经元可存活半个月以上．仍保持较好形态。
本实验选用培养６～８ｄ的细胞．在进行荧光负载前，先在明场下选择细胞膜界限清晰、胞体光亮、形态良好，同时可清楚分辨胞体的细胞，见图ｌ。
２．２荧光负载后细胞：以荧光染料ｆｌｕｏ一３进行负载后．在荧光显微镜下可以看到负载后的细胞胞体发出绿色荧光。
由于显微镜可测灰度值变化范围在０～２５５．若超出此范围则不能正常工作，所以此时要调整荧光强度。
以能够明确分辨细胞为准。
本实验所用细胞荧光负载后见图２。
２．３９０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ引起的细胞内Ｃａ“反应：在本实验中。
给予９０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＫＣＩ，以确定细胞的状态。
可以看到给ＫＣＩ后，［Ｃａｚ＋］ｉ快速明显升高，增幅超过１００％，证明细胞保持良好状态。
给予ＫＣＩ后，［Ｃａ“］ｉ的静态图片和动态变化曲线分别见图３，４。
３讨论３．１细胞培养介质的选择：对于培养细胞的介质，可以有多种选择。
例如使用不同大小的盖玻片或直接将细胞培养于单个的３５ｍｍ培养皿、６孔板、２４孑Ｌ板、９６孔板均可。
目前，随着ＬＣＳＭ的发展，已有其专用的培养皿．但只能一次性使用，且成本较高。
此外，也可自制专用于测钙的小皿，选择合适大小的培养皿．在其底部中心．根据培养细胞所用盖玻片的大小，可以自制一相应大小的圆孔，底部外侧贴较大盖玻片。
内侧孔内置入带有培养细胞的盖玻片，可重激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用（正文见第５３０页）图１培养大鼠皮层神经元形态结构ＬＣＳＭｘ６００图２荧光负载后细胞形态结构及荧光强度ＬＣＳＭｘ６００图３给予９０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ后细胞荧光强度明显升高ＬＣＳＭ×６００图４给予ＫＣｌ后［ｃａｚ＋］ｉ的动态变化曲线氯沙坦对大鼠肾脏缺血再灌注足细胞损伤保护作用的实验研究（正文见第５３６页）图１各组大鼠肾组织足细胞电镜改变（ａ：假手术组；ｂ：缺血组；ｃ：缺血再灌注组；ｄ：氯沙坦治疗组）ｘ８０００图２免疫荧光检测各组大鼠肾组织中ｎｅＤ¨ｎ变化（ａ：假手术组；ｂ：缺血组；ｃ：缺血再灌注组；ｄ：氯沙坦治疗组）ｘ２００激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用作者：武美娜， 李新毅， 白玮， 郭芬， 祁金顺， WU Mei-na， LI Xin-yi， BAI Wei， GUO Fen， QI Jin-shun作者单位：武美娜,郭芬,祁金顺,WU Mei-na,GUO Fen,QI Jin-shun(山西医科大学生理教研室,太原,030001)， 李新毅,LI Xin-yi(山西医科大学第一医院神经内科)， 白玮,BAI Wei(山西省肿瘤医院病理科)刊名：中国药物与临床英文刊名：CHINESE REMEDIES & CLINICS年，卷(期)：2008,8(7)被引用次数：4次1.Hidalgo C;Nú(n)ez MT Calcium,iron and neuronal function[外文期刊] 2007(4-5)2.赵彩霞;郑延松;田敏细胞内游离钙检测方法进展[期刊论文]-国外医学(临床生物化学与检验学分册) 2001(02)3.Chen JT;Chen RM;Lin YL Confocal laser scanning microscopy:an overview of principle and practice in biomedical research 2004(01)4.Amos WB;White JG How the confocal laser scanning microscope entered biological research 2003(06)1.高秀萍.祁金顺.乔健天.GAO Xiu-ping.QI Jin-shun.QIAO Jian-tianβ-淀粉样蛋白25-35片段抑制大鼠皮层神经元大电导钙激活钾通道[期刊论文]-中华神经医学杂志2006,5(5)2.武美娜.祁金顺.乔健天.WU Mei-Na.QI Jin-Shun.QIAO Jian-Tianβ-淀粉样蛋白抑制海马长时程增强机制的研究进展[期刊论文]-生理科学进展2006,37(3)3.祁文秀.张宇.祁金顺.乔健天.Qi Wenxiu.Zhang Yu.Qi Jinshun.Qiao Jiantian大鼠鞘内注入前强啡肽原的反义寡聚核苷酸减弱福尔马林引起的脊髓背角中强啡肽A的合成和行为痛反应:细胞免疫化学和行为学联合观察[期刊论文]-神经解剖学杂志2003,19(4)4.张俊芳.侯磊.郭芬.祁金顺.ZHANG Jun-fang.HOU Lei.GUO Fen.QI Jin-shun大鼠在体海马CA1区长持续长时程增强的记录[期刊论文]-山西医科大学学报2009,40(1)5.乔健天.韩中胜.祁金顺.QIAO Jian-Tian.HAN Zhong-Sheng(Victor).QI Jin-Shun中枢神经元树突电活动和树突返传动作电位在突触可塑性调控中的作用——悼念树突功能研究的先驱张香桐院士[期刊论文]-生理学报2008,60(2)6.林元相.徐如祥.姜晓丹.康德智.柯以铨.杜谋选.蔡颖谦.Lin Yuan-xiang.Xu Ru-xiang.Jiang Xiao-dan.Kang De-zhi.Ke Yi-quan.Du Mou-xuan.Cai Ying-qian激光共聚焦扫描显微镜动态观察体外培养大鼠皮层神经元受氯化亚铁作用时过氧化物水平及膜电位的变化[期刊论文]-中国临床康复2006,10(17)7.郭芬.武美娜.景玮.祁金顺.GUO Fen.WU Mei-na.JING Wei.QI Jin-shun双电极绑定技术记录在体大鼠海马CA1区长时程增强[期刊论文]-中国应用生理学杂志2007,23(3)8.周永军.牛中奇.侯建强.陈建华.白冰.黄华.ZHOU Yong-Jun.NIU Zhong-Qi.HOU Jian-Qiang.CHAN Jian-Hua. BAI Bing.HUANG Hua细胞内自由钙离子浓度变化的时-频分析[期刊论文]-中国生物医学工程学报2009,28(6)9.殷文娟.李新毅.祁金顺CaMKⅡ磷酸化介导海马长时程增强的诱导及淀粉样β蛋白引起的长时程增强伤害[期刊论文]-中西医结合心脑血管病杂志2008,6(5)10.殷文娟.祁金顺海马LTP/LTD诱导中CaMKⅡ磷酸化水平的变化[期刊论文]-山西医药杂志2009,38(4)1.郝莹莹.施志仪.李文娟.靳雨丽维生素D3对三角帆蚌外套膜细胞内 Ca2+浓度的影响[期刊论文]-动物学杂志2011(3)2.吴海涛.江涌.张晓冬.夏海坚.唐兆华.孙晓川载脂蛋白E基因多态性对星形胶质细胞损伤早期胞内Ca2+浓度的影响[期刊论文]-中华创伤杂志 2010(8)3.周丽娜.叶文博野木瓜注射液及其提取物对脊髓神经元的氧化保护和生长促进作用[期刊论文]-上海师范大学学报（自然科学版） 2011(5)4.芦鑫.程永强.李里特研究蛋白质凝聚凝胶的技术进展[期刊论文]-中国粮油学报 2010(1)本文链接：/Periodical_zgywylc200807007.aspx。