转基因动物生产综述【摘要】近几年，转基因技术已成为生物界的研究热点，转基因动物作为一项生物高新技术成果，涉及到农牧业、生物医学和药物产业等诸多方面，显示出了广阔的应用前景与重要的经济价值。
转基因技术对影响21世纪人类生存的重大环境、健康等问题的最终解决将发挥不可估量的作用，如改良动物经济性状提高经济效益、建立疾病动物模型从而加快人类疑难杂症的治愈、生产高价值的生物药品等。
随着理论上和技术上的不断完善，转基因动物必将真正进入产业化和市场化，成为生产行业中的一种新兴产业。
本文就转基因动物生产的方法、转基因动物的应用及存在的问题等作一综述。
【关键词】转基因；动物；生产；应用；问题遗传的基本物质是DNA，基因则是位于染色体上有遗传效应的DNA片段，对于储存在生物全套染色体中的全部遗传信息，可称其为基因组。
由于不同种类、不同个体的生物基因组成是不同的，因此对动物个体来说，非自身的基因成分属于外源基因，如果把外源基因整合或导入动物染色体基因中，那么这个外源基因就被称为转基因 (即转移来的基因)，这种动物就是转基因动物。
1976年，Jaenisch 首次利用反转录病毒感染胚胎的方法获得了转基因小鼠。
1980年Gordon等人采用受精卵原核显微注射的方法，将外源基因导入小鼠受精卵，获得了转基因小鼠。
随后各种转基因动物相继出现，直到1997年，英国科学家Wilmut等获得了世界首例体细胞克隆动物，成为转基因技术的一个转折点。
从此，利用体细胞克隆生产转基因动物的研究在世界各地广泛而深入地开展起来，取得了一系列重要成果。
自 20 世纪70年代初诞生以来，转基因技术一直是生命科学研究和讨论的热点之一。
随着研究的不断深入和实验技术的不断完善，它的研究成果在提高生产力、改善畜产品质量、生产生物医药产品、研究人类疾病模型，治疗人类的疑难病症方面都显示出了广阔的应用前景。
1 生产转基因动物的方法生产转基因动物的常用方法有：原核期胚胎显微注射法、精子载体法、慢病毒载体法、胚胎干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等。
1.1原核期胚胎显微注射法原核内显微注射是由美国人Gordon发明的，是目前应用最广泛、发展最早的方法之一。
这种方法的优点是外源基因易整合入染色体，导入的基因大，可使用任何载体承载基因片段，也可注射无载体的基因片段，外源基因的长度可达100kb，实验周期相对比较短。
但其不足之处是：由于基因整体进入染色体的随机性，使外源基因整合位点和拷贝数无法控制，外源基因随机整合到基因组内常导致宿主 DNA中的染色体序列丢失、重排、插入、突变，有的甚至造成严重生理缺陷，而且设备昂贵、操作复杂。
该方法的外源基因转移整合率小鼠为6%~10%，猪和羊分别为0.98%和1%，鱼类通常可达10%~15%。
1.2精子载体法精子载体法是利用动物精子具有自发结合和内化转运外源DNA能力的特点，使其在受精时导入卵母细胞，获得转基因动物。
1989年Lavitrano等首次把PSV2-CAT质粒与小鼠的附睾精子共育后进行体外受精，移植后获得了阳性鼠。
目前利用精子载体法已获得了猪、牛、羊、兔、小鼠以及鱼等转基因动物后代，其中小鼠、猪、兔都建立了表达外源基因的转基因株系。
以精子作载体的最大优点是克服了人为机械操作给胚胎造成的损伤；且简单、易行，不需昂贵的显微操作设施及复杂的操作技巧，该方法在转基因家畜生产中具有技术和效率上的优势；主要缺点是实验结果不稳定，可重复性差。
其中进入精子核内的 DNA结构是否完整、DNA进入核内的精子比例有多少、DNA 进入核内的精子受精能力怎样以及其受精后能否成功嵌入胚胎染色体中等，是精子介导基因转移技术能够取得长足发展的最为敏感而又必须解答的问题。
1.3 慢病毒载体法慢病毒属于逆转录病毒科，能够感染分裂细胞和非分裂细胞，因而被发展成为重要的转基因载体。
逆转录病毒感染法是将目的基因重组到逆转录病毒RNA载体上，慢病毒感染宿主细胞后，病毒RNA反转录为DNA后可以整合到宿主细胞的染色体上并长期稳定表达。
慢病毒载体法用于制作转基因动物的优点是方法简单，不受胚胎发育阶段的影响，而且外源基因多位点，单拷贝整合效率高，特别适用于转基因家禽的生产。
但是存在病毒载体构建复杂，转入的外源基因的大小受到限制，安全性需提高，可能会造成基因沉默等问题。
1.4 胚胎干细胞介导法胚胎干细胞是早期胚胎内的细胞团经体外培养建立起来的多能细胞系，具有全能性，在一定条件下可发育成完整个体。
因此，把外源基因导入干细胞后，经过选择，再把阳性细胞注入另一胚胎囊胚腔中，或与另一胚胎卵裂球聚合，再经过选育即可得到转基因动物。
在转基因领域，胚胎干细胞是公认的研究基因转移、基因定点整合极有前途的实验材料，利用这种方法制作转基因小鼠的阳性率近100%，遗憾的是第一代一般是嵌合体，要通过杂交繁育才能得到纯合目的基因的个体。
截至目前世界范围内只有小鼠干细胞的建系方法比较成熟。
1.5体细胞克隆介导法体细胞克隆介导法首先要筛选出已整合了目标基因的细胞，建立转基因细胞系，然后再用去核卵母细胞作受体，用转基因细胞系的细胞核作供体，通过核移植产生重植胚胎。
Wilmut研究小组在取得克隆绵羊多利（Dolly）后，同年 12 月又在美国的《Science》发表了一文，以外源基因转染胚胎成纤维细胞，获得了能表达治疗人血友病的凝血因子Ⅸ转基因克隆羊“波利（Polly）”。
利用体细胞核移植制备转基因动物，虽然胎儿的死亡率高，但其得到转基因动物的总效率高于原核显微注射法。
其产生的转基因后代遗传背景及遗传稳定性一致，不需选配就可建立转基因群体。
1.6 人工染色体介导的基因转移法人工酵母染色体载体（YAC）是近年发展起来的新型载体。
具有克隆百万碱基对级（Mb）大片段外源基因的能力，可以保证巨大基因的完整性，保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变，从而提高较长外源片段在转基因动物中的整合率。
其技术途径有二：一是 ES 细胞转染 YAC 后体外筛选，阳性ES细胞囊胚腔注射；二是 YAC 的原核显微注射。
1996年Berm通过此法获得转基因兔。
1997年，Fujiwara等建立了210kb人类乳清蛋白 YAC DNA 转基因小鼠。
2008年，中国农业大学的李宁等利用细菌人工染色体（BAC）生产出能够大量表达人体乳铁蛋白的转基因奶牛。
2 转基因动物的应用2.1作为人类疾病的动物模型完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始和发展，并可为测试各种可能的治疗提供一个统一有效的方案。
现代医学研究证明，人类的大多数疾病都与遗传有关。
转基因动物模型通过精确地失活某些基因或增强某些基因的表达来制作各种人类疾病的模型，对研究因基因突变而引起的遗传疾病的发病机制十分有效。
目前有关疾病的动物模型主要用于诊断和开展遗传疾病的研究，例如：在1996 年Gringrich 等将 Probasin 的启动子中一段 454bp 的序列与 SV40 序列连接，转入小鼠受精卵，建立了转基因小鼠前列腺癌动物模型 TRAMP。
现已建立起动物模型的疾病有：癌症、动脉硬化、镰刀状细胞贫血、地中海贫血肝炎、淋巴系统病、老年痴呆症糖尿病和高血压等。
2.2生产可用于人体器官移植的动物器官供体器官来源不足和人类移入的器官多发生免疫排斥现象一直是困扰医学界的难题。
每年由于可供移植的人体器官不足，成千上万的病人因得不到移植器官而死去。
据报道，2001年美国可以进行器官移植的人数与需要进行器官移植人数的比例大约为 1∶4。
目前对器官供体动物研究较多的是猪。
猪作为人类器官移植的供体在解剖、组织及生理等方面与人类最为相近，其器官与人的器官大小相仿，并且容易饲养，不存在伦理方面的问题。
转基因动物技术的应用为解决这两大难题开辟了一条崭新的途径。
Lai 等和 Dai 等结合基因打靶和体细胞核移植技术，采用敲除α3半乳糖转移酶基因的胎儿成纤维细胞作核供体，成功地获得了α3半乳糖转移酶基因敲除猪。
α3半乳糖转移酶为α3半乳糖合成所必需，该半乳糖能被人体免疫细胞所识别，引发排斥反应。
将猪基因组中该基因敲除后，可直接阻止猪细胞表面α3半乳糖的合成，从而消除了猪作为人类器官供体的一个主要障碍。
2.3 作为生物反应器生产药物和营养保健品通过转基因动物生产珍贵的多肽或蛋白类药物，是当前转基因动物的研究热点，这种转基因动物被称为生物反应器。
乳腺生物反应器是目前发展最成熟的一种模式同时也是一种可以获得巨额经济利润的新型产业。
据美国红十字会和遗传学会预测：到 2010年,动物乳腺反应器生产的药物将占所有基因工程药物的95%，具有巨大的市场价值。
2008年北京科润维德生物技术有限责任公司转基因动物试验基地成功克隆出携带人CD20 抗体基因的转基因奶牛———“贝贝”这是世界首次获得转 CD20 基因的转基因奶牛。
“贝贝”和它的十几个“同胞们”之所以特殊，是因为它们长大后产生的牛奶含有人CD20单克隆抗体，该抗体是目前治疗B淋巴细胞瘤等恶性肿瘤的特效药物。
我国先后成功获得了能够在乳腺中表达多种药用蛋白或营养保健蛋白的转基因牛、绵羊和山羊，总体技术能力基本达到发达国家的先进水平。
1992 年 Swanson 等制备了血液中含有人血红蛋白的转基因猪。
1997年，英国科学家 Wilmat 等成功获得了整合人凝血因子Ⅸ的转基因绵羊，可从其乳汁中获取大量昂贵的医用人凝血因子Ⅸ。
1998年2月，上海医药遗传研究所与复旦大学遗传研究所培育出携带人凝血因子（抗血友病因子β）基因的转基因羊；1999年3月，相同单位又获得携带有人血清白蛋白基因的转基因试管公牛。
市场上对血液产品的需求量是巨大的，这为从人以外的动物体获取珍贵的人血有效成分提供了一条新途径。
生产具有医用价值的生物活性蛋白还可以通过其他途径获得，包括：蛋清、精浆、膀胱、蚕茧等。
2.4 提高动物生长率“超级小鼠”的研究成功为培育大型动物开辟了新思路，掀起了向动物体内导入 GH（生长激素）基因研究的热潮。
20世纪80年代育成的各种转基因哺乳动物中，都是以整合表达各种不同来源的 GH基因为主，其中猪是主要目标。
1985年Hammer将人的GH基因导入猪的受精卵获得成功，转基因猪与同窝非转基因猪比较，生长速度和饲料利用效率显著提高，胴体脂肪率也明显降低。
1989 年，美国的Pursel等人把牛的生长激素基因转入猪，生产出 2个猪的家系，其生长速度提高11%~14%，饲料转化率提高 16%~18%。
2.5 动物抗病育种将抗病毒基因导入受精卵，由此发育成的个体将具能减轻该种病毒侵染时为机体带来的危。
1992年Berm将小鼠抗流感基因转入了猪体内，使转基因猪增强了对流感病毒的抵抗能力。
2000年，Kerr等将溶葡萄球菌酶基因转入小鼠乳腺，用来防治由金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎，结果证实高表达量的小鼠乳腺具有明显的抗性，这对于防治奶牛乳腺炎具有潜在的应用前景。