基同步培养离心洗涤玻璃珠震荡分散过滤
单细胞或孢子悬浮液
诱
活菌计数
诱变处理 诱变处理预备实验
变
处理液活菌计数 平板分离
育
形态变异并计算其变异率
种
斜面培养
初筛、复筛 自然分离和再复筛
保藏及扩大试验
• 出发菌株的选择 • 诱变剂的选择 • 诱变操作（包括诱变剂量的选择） • 突变株的筛选 • 突变高产菌的表现及筛选条件的配合
藻类工 厂
第二节 菌种的来源
一、微生物选择性分离方法 • 含微生物材料的选择 • 材料的预处理 • 所需菌种的分离 • 菌种的培养 • 菌种的选择和纯化
1、含微生物材料的选择 • 微生物主要来自土壤 • 寻找已经适应苛刻环境压力的微生物类群 • 例如：从盐场分离嗜盐链霉菌，从污泥中分离甲烷菌，从酒糟中分离酵母菌等。
），保证安全
二、工业上常用的微生物
• 微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石 油化工等方面。
• 微生物的代谢产物多，已超过1300多种，而用于大规模工业生产的不足100多种；微生物酶 有近千种，而工业上用的不过40－50种。微生物具有巨大的潜力可挖掘。
• 工业上常用菌种举例：
碱性蛋白酶的产生菌能消化平板的不溶性蛋白， 产生一清晰圈。
• 随机分离方法：
1、制备一系列含有各种类型营养成分（生长 限制因素）培养基；
2、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引 起分解代谢物阻遏）；
3、加入缓冲液以减少pH的变化；
4、确定含有所需的辅助因子Co2+,Mn2+,Mg2 +,Fe2+等。
生长因子产生菌的筛选： 通过观察分离菌能否促进营养缺陷型（auxotroph）的生长，便可检出生长因子产生
菌。
多糖生产菌的筛选： 从制糖工业的废水中可获得分离株，在适当的培养基中生长，可从菌落的粘液状外观识 别这类产生菌。
第三节、菌种的选育
一、自然选育 1、采样 采样对象
以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水 化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象 也可以是植物，腐败物品，某些水域等。
初筛：以量为主 复筛：以质为主
二、诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突 变。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。
诱变剂
物理：紫外线，快中子 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍 生物：噬菌体
诱变育种的主要环节 （1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液
——诱变 （2）用合适的方法淘汰负效应变异株，
选出性能优良的正变异株——筛选
• 解决办法：把富集培养物接种到新鲜的同一种培养基中可以重新建立选择压力，重复移植 几次后，将富集培养物再接到固体培养基上。
２、固体培养基培养：
常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含 有所需酶的基质，以便促进酶产生菌的生长。
e.g. 碱性蛋白酶的分离
用不同pH的土壤作为原始种子。土壤必须经过巴 氏灭菌消毒，以减少不产孢子的微生物，然后铺在pH 为9~10的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表 面。
噬菌体（phage）是病毒的
一种。 噬菌体在寄主细胞中的生长
繁殖过程可分为吸附、浸入、增 殖、成熟和释放。
C：藻类（alga）： 培养螺旋藻，每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才 可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。 还可通过藻类将CO２转变为石油，培养单胞藻或其他藻 类而获得的石油，可占细胞干重得5%-50%，合成的油与重 油相同，加工后可转变汽油、煤油等产品。还可减轻因工业 生产而大量排放CO２造成的温室效应。 国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养藻 类，利用其光合放氢作用来取得氢能。
抗生素生产菌的筛选：
把潜在的产生菌生长在含有试验菌的平 板上，可以鉴定产生菌的抗微生物作用。
也可以将微生物分离株生长在液体培养 基中，检测其无细胞滤液的抗菌活性。
药理活性化合物生产菌的筛选：
一种化合物如果能在体外抑制某种关键 的人体酶，它就可能在体内具有药理作用。
若将体外筛选出的活性化合物，再用动 物作试验，可筛选出新的药理活性化合物生 产菌。
二、重要工业微生物的分离方法
•施加选择压力的分离方法：
1 、富集液体培养 ：指能增加混合菌群中所 需菌株的数量的一种技术。
要领： 给混合菌群提供一些有利于所需菌株 生长或不利于其他菌群生长的条件。
e.g. 供给特殊的基质或加入某些抑制剂。
• 注意：所需类型的菌株生长的结果，有时会改变培养基的性质，从而改变选择压力，使其 他微生物生长。
变异株 代谢控制育种 基因工程定向育种
微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：
（1）所需培养基易得，价格低廉； （2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等） （3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短 （4）单产高 （选择野生型、营养缺陷型或调节突变株）
（5）抗病毒能力强 （6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好 （7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素
固体培养基的稀释涂抹接种法
需要使用的仪器——震荡机
吸取准备好欲稀释的菌液
吸取充分均匀后的菌液
取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。 将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。
将 试 管 于 震 荡 机 上 ， 使 菌 液 混 合 均 匀
取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL， 加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。 重复此步骤直至所需要的稀释浓度。
形态突变 高产突变 耐药性突变 营养缺陷型突变 结构类似物抗性突变
• 形态突变型：指发生细胞形态变化或菌落形态变化的突变 型。
步骤七
由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上 图。
步骤八
重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中 划出第三区，如右上图。
步骤九
重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区 中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营 养平板，如右上图。
步骤十
在营养平板上贴好标签， 标示好接种日期、操作者 姓名、菌种学名以及培养 基名称。
• 在分离培养基中广泛采用加入抗生素的方法，来增加选择性。
4、菌种的培养
• 放线菌：25-30℃。多数放线菌是好气的，因此必须保证 足够的通气量；多数放线菌的最适生长温度为23-37℃， 高温放线菌的生长温度范围在50-65℃。
• 嗜热菌：45-55 ℃。它能够产生耐热性蛋白质，在高温条 件下，普通生物的蛋白质就会失活、变性，但是嗜热菌 蛋白质不会变性，生命活动也不会终止。
• 收集在腐烂的稻草和其它植物材料中的嗜热放线菌孢子可在 空气搅动下进行，并可用简单的沉淀室收集孢子。然后，用 取样器将空气撞击在培养基的平板上，这样可以减少分离平 板中的细菌数目。
• 在分离前添加一些固体基质(如把几种基质加在土壤中)或洒 些可溶性养分来强化培养基。
• 所谓诱饵技术是将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌 落长成后再铺平板。有人曾广泛使用石腊棒技术来分离诺卡 氏菌，从土壤中分离耐酸放线菌。近来,用花粉诱饵从土壤中 分离出13株小瓶菌，其中有些新种或亚种。
• 嗜冷菌：4-10 ℃。嗜冷菌是指那些能在低于7℃时可以生 长繁殖的细菌，例如假单胞菌黄杆菌、产碱杆菌和色杆 菌属等。
5、菌落的选择
• 铺菌法 于分离平板上铺上一层单一的试验菌的办法用来测定各个菌落的抗生素生产能力。 • 复印平板法 将菌落复印在平板上的办法来研究它们对一系列试验菌的作用。
这两种方法都有缺点。铺菌法会使所需要的菌落污染，并且只能在每个平板上铺上一种试 验菌。菌落复印平板法对不长孢子的链霉菌则不能使用，也不适用于游动细菌的筛选。
面包酵母
3、霉菌
• 曲霉属 • 应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶
• 应用：酱油、酱类（淀粉酶）
• 米曲霉 • 应用：产糖化酶和蛋白酶
、主要用于酿酒制曲和酱 油制曲
应用：生产甲义丁 二酸
毛霉
• 应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作
• 根霉
• 种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根 霉
从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液， 置入准备好的无菌琼脂内。
将三角玻璃棒浸于酒精中
将三角玻璃棒在火焰上燃烧 （须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）
使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于 恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数 推算出菌液浓度。
4、生产性能的测定 一般采用两步法：
1、常用的细菌
•
大肠杆菌
应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。
乳酸杆菌
应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶 等的制作
枯草芽孢杆菌 应用：生产淀粉酶
2、酵母菌
种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母。 应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪。
啤酒酵 母
红酵 母
固体培养基四区划法接种法介绍如下：
步骤一
接种针先以火焰灭菌法灭菌
步骤二
轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却
步骤三
以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。
步骤四
更换一个新的无菌营养平板
步骤五
将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。 此为第一菌区 。
步骤六
重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法 灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。
• 采样季节： 以温度适中，雨量不多的秋初为好。
• 采土方式： 在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸
袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。
2、增殖培养 方法：控制培养基成分 控制培养条件 抑制不需要的菌类