5、质粒的分离与检定 提取所有胞内DNA后电镜观察； 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；
几种代表性质粒
1. F质粒（fertility factor）：又称F因子、致育 因子或性因子。是E.coli等细菌决定性别并有 转移能力的质粒。存在于肠细菌属、假单胞菌 属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中。
松弛型质粒(relaxed plasmid)：与核染色体的不同 步复制，这类细胞中含10—15甚至更多个质粒。
4、质粒在基因工程中的应用
质粒的优点：
（1）体积小，易分离和操作 （2）环状，稳定 （3）独立复制 （4）拷贝数多 （5）存在标记位点，易筛选 E. coli的pBR322质粒是一 个常用的克隆载体
携带F质粒的菌株称为 F+菌株（相当于雄性）， 无F质粒的菌株称为F-菌 株（相当于雌性）。
2.R质粒（resistence factor）
包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。 抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。
抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因 R质粒 抗性决定因子：抗性基因
选 用 TMV 和 霍 氏车前花叶病 毒 （ HRV ） ， 分别拆分取得 各 自 的 RNA 和 蛋白质，将两 种 RNA 分 别 与 对方的蛋白质 外壳重建形成 两种杂合病毒：
– （1）RNA（TMV） 蛋白质（HRV） – （2）RNA（HRV） 蛋白质（TMV）
用两种杂合病毒感染寄主：
– （1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV 粒子
例如：粘质沙雷氏菌：在25℃下培养，产生深红色的灵 杆菌素；在37℃下培养，不产生色素；如果重新将温度 降到25℃，又恢复产色素的能力。
第一节 遗传变异的物质基础
种质连续理论：1883~1889年间德国Weismann提出。认为遗 传物质是一种具有特定分子结构的化合物。
基因学说：1933年摩尔根（Thomas Hunt Morgan）发现了 染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因 学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。
3. Col质粒（colicinogenic factor）
Col质粒:能编码大肠菌素基因，大肠菌素是一种细菌蛋白，只杀死近缘且 不含Col质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素影响。
许多细菌都能产生抑制或杀死其他近缘细菌或者同种不同菌株的代谢产物， 所以称为细菌素。
细菌素
抗生素
抑制或杀死近缘，甚至同种不同株的细菌
活R菌+S菌无细胞抽提液——长出大量R菌和 少量S菌
以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能 存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞 并使R型细胞获得稳定的遗传性状，转变为S型细胞。
1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M.McCarty从热 死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种 成分，并在离体条件下进行了转化试验：
即诱癌质粒。
引起双子叶植物冠瘿 瘤的致病因子，其宿 主是一种根癌土壤杆 菌，是当前植物基因 工程中使用最广、效 果最佳的克隆载体。
5.Ri质粒
存在于发根土壤杆菌中，引起许多双子叶 植物患毛根瘤。 可作为外源基因的良好载体和合成次生代 谢产物。
6. mega质粒（巨大质粒）
是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的 一种质粒，分子量为200~300×106Dalton， 比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒， 其上有一系列固氮基因。
野生型（wild type）：从自然界分离到的任何微生 物在其发生突变前的原始菌株
突变体（mutant）：野生型经突变后形成的带有新 性状的菌株
（一）基因突变的类型
按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来 分：
选择性突变株（selective mutant）：具有选择标 记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变 型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、 pH值等，就比较容易检出和分离到。
物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段。
6、密码子水平 遗传密码是指DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序 每一密码子由3个核苷酸序列即1个三联体组成。
7、核苷酸水平 是一个最低突变单位。 绝大多数生物的DNA由腺苷酸、胸苷酸、鸟苷酸和胞苷酸组成。
三、原核生物的质粒
1.定义：
遗传型 + 环境条件 代谢
表型
发育
表型（phenotype）：指某一生物体所具有的一切外表特征和 内在特性的总和，是其遗传型在合适环境条件下通过代 谢和发育而得到的具体体现。
——是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定 条件下所表现出的具体性状。
遗传与变异的概念
变异(variation):生物体在某种外因或内因的作用下所引 起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。 变异的特点：a.在群体中以极低的几率出现，（一般为 10-6～10-10）；b.性状变化的幅度大； c. 变化后形成的 新性状是稳定的，可遗传的。 饰变（modification）：一种不涉及遗传物质结构改变 而只发生在转录、转译水平上的表型变化。 特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的 变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰 变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。
对各种生化组分进行转化试验
只有S型细菌的DNA才能将S. pneumoniae的R型转化为S 型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转 移给R型菌株的是以DNA为遗传物质基础的遗传信息。
（二）噬菌体感染实验
（三）植物病毒的重建实验
为了证明核酸是遗传物质，H. FraenkelConrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒 （TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能 将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。
附加体(episome)：某些质粒具有与核染色体整合、脱离的 功能，这类质粒称附加体。
②质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不 同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种。
3、质粒的类型
严紧型质粒(stringent plasmid)：与核染色体的同 步复制，这类细胞中仅含1—2个质粒。
3、染色体水平：不同微生物染色体数目不一样，多数微生物是单 倍体，少数情况下是双倍体，如合子。
4、核酸水平 除病毒的遗传物质有RNA外，其余生物的遗传物质是DNA 除病毒的遗传物质有单链的RNA或DNA外，其余生物的遗传物质 是双链DNA 不同微生物基因组差别极大
5、基因水平 基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位，其
质粒（plasmid）：凡游离于原核生物核基因 组外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状 的dsDNA分子，即cccDNA，就是典型的质粒。
2、结构特点
通常以共价闭合环状的超螺旋双链 DNA分子存在于细胞中；也发现有线 型双链DNA质粒和RNA质粒；
3.质粒的性质
①可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态）， 也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的 形式存在；
较广的抗菌谱
通过核糖体直接合成的多肽类物质
一般是次级代谢产物
编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位 一般无直接的结构基因，相关酶的基因多在
于质粒或转座子上
染色体上
大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），大肠杆菌 素是由Col质粒编码。
4. Ti质粒（tumor inducing plasmid）
遗传与变异的概念
遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。
遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物 传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点： 具稳定性。
遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有 的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。
——是一种内在可能性或潜力。
（二）突变率
定义：某一细胞（或病毒粒）在每一世代中发 生某一性状突变的几率。
突变率：可采用营养缺陷型的回复突变株或抗 药性突变株来检测。
例如：突变率为10-8：一亿次分裂中，会发生 一次突变。
若干细菌某一性状的自发突变率
菌
名
E. coli
E. coli
突变性状
抗T1噬菌体 抗T3噬菌体
E. coli
对小鼠注射活R菌或死S菌 ————小鼠存活 对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡 对小鼠注射活R菌和热死S菌 ———小鼠死亡
抽取心血分离
活的S菌
加热杀死的S型细菌里可能存在一种具有遗传转化能力的物质，它能通过 某种方式进入R型细胞，使其获得S型的遗传特性
（2）细菌培养实验
热死S菌——平—皿—培养—不生长 活 R 菌—平—皿—培养——长出R菌 热死S菌——平+活皿—培R—菌养 —长出大量R菌和10-6SI菌 （3）S型菌的无细胞抽提液试验
但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种 氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎 可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般 仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列核组合只能产生 较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体 和基因，起活性成分是蛋白质。
DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，先后有利 用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证（肺炎链 球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试 验），才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。
7. 降解性质粒
降解性质粒：这类质粒可为降解一系列复杂有机物 的酶编码，可在污水处理、环境保护等方面发挥特 有的作用。 含有数种降解性质粒的菌株“超级菌”
第二节 基因突变和诱变育种
一、基因突变