一般蛋白质含氮量为16%，即一 份氮素相当于6.25份 蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞 麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95， 大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为 6.38。
二、 蛋白质测定方法
（一）蛋白质测定方法概述 测定蛋白质的方法可分为两大类： 一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、 肽键和折射率测定蛋白质含量 ； 另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残 基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定 蛋白质含量。
Rf = a/b 溶剂前沿 b 样点 a
点样原点
① ② ③ ④ ⑤
凯氏定氮法：常量法、半微量法、微量法及经改进 后的改良凯氏定氮法，自动凯氏定氮仪等。 微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一 套微量凯氏定氮器 目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量 凯氏定氮法。 在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完 全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样 所用的催化剂。 常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。
滴定系统以及全面运行监控系统，采用国家/国际标准法—颜色指示法检测终点，自动化程度高（消化好的样品直接上机自动完 成分析和计算全过程），稳定可靠，运行成本低，最大限度地保证操作人员的安全及结果的准确性和精度。检测结果（12种表 示法）直接在显示屏显示及打印。内置的计算机可将检测数据向PC机及LIMS系统转移。
（六）氨基酸含量的测定 1.甲醛滴定法 2.茚三酮的比色法
1.甲醛滴定法
（1）原理：氨基酸本身有碱性 —NH2— 基，又有酸性 — COOH 基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，甲醛与— NH2—结合，碱性消失，再用强碱来滴定—COOH 基。
（2）适用范围：适用于发酵工业，如发酵液 中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况及 食品中游离氨基酸的测定等。 （3）试剂 ① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂， 用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。 ② 0.1%百里酚酞乙醇溶液， ③ 0.1%中性红50%乙醇溶液， ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。
（1）消化
2NH2(CH)2COOH ＋ 13H2SO4 ＝ (NH4)2SO4 ＋ 6CO2 ＋ 12SO2 ＋ 16H2O
一定要用浓硫酸（98%）
（2）蒸馏、吸收
2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↑＋ Na2SO4 ＋ 2H2O
按左图连接好装置，塞紧瓶口， 冷凝管下端插入吸收瓶下（瓶 中有50ml4％硼酸和混合指示 剂）。放松夹子，加入70～ 80ml氢氧化钠溶液，至瓶中溶 液变为深蓝色或产生黑色沉淀， 再加入100ml蒸馏水，夹紧夹子， 加热蒸馏，至氨全部蒸出 （250ml）。
NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这 种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构 相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下， 其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计 来测其吸光度，确定含量。（560nm）
（10）蒸馏前如加碱不足，消化液呈蓝色不生成 氢氧化铜沉淀，此时需增加氢氧化钠用量。向蒸 馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是 由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧 化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时 铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物 [Cu(NH3)4]2+ （11）蒸馏装置不能漏气。 （12）蒸馏结束时，使冷凝管下端离开液皿，用 少量水冲洗冷凝管下端外部，再蒸馏1min，然后 关闭热源，否者可能造成吸收液倒吸。 （13）氨是否完全蒸馏出来，可用pH试纸试馏出 液是否为碱性。
3、步骤
样品消化→ 蒸馏、吸收→ 滴定
（1）消化
准确称取固体样品0.2～2.0g， 液体10～20ml，置于500ml凯 氏烧瓶中。 加入硫酸铜0.5g，硫酸钾10g， 浓硫酸20ml，摇匀。 置于电炉上，成45度角，小火 加热。 待泡沫停止后，加大火力，保 持微沸，至液体变蓝绿色透明， 再继续加热0.5～1h，取下冷却 后，小心加入20ml水，转移至 1000ml容量瓶，定容。
（3）操作：同时取两份样： 一份中加中性红指示剂，用氢氧化钠直接 滴，中和样液中其它酸性物质。 另一份中加百里酚酞、中性甲醛用NaOH 滴， 中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物 质的总和。 二者之差可计算氨基酸含量。
2.茚三酮的比色法
原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应， 生成蓝紫色化合物，可比色定量。
2、仪器和试剂
（1）500ml凯氏烧瓶 （2）定氮蒸馏装置 （3）试剂： 硫酸铜； 硫酸钾； 硫酸；含蛋白质试样 40g/L硼酸溶液： 混 合 指 示 剂 ： （ 国 标 ） 1 g/L 甲基 红 乙 醇 溶 液 与 1g/L甲基蓝乙醇溶液，临用时按2﹕1的比例混合。 或者 1g/L甲基红乙醇溶液与 1g/L溴甲酚绿乙醇溶液， 临用时按1 ﹕ 5的比例混合； 400g/L氢氧化钠； 0.1mol/L盐酸标准溶液
第五节 含氮量的测定
一、概述 二、含氮量的测定方法
一、概述 （一）食品中的蛋白质含量
在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同， 一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食 品，例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，猪肉 中为 9.5% ，兔肉为 21% ，鸡肉为 20% ，牛乳为 3.5%黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%，大豆为40%， 稻米为8.5%，面粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜 为1.0%，桃为0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4% 和油菜为1.5%左右。
（14）吸收液也可以用0.01当量的酸代替硼酸，过剩 的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗 碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余 均相同。 （15）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作， 且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操 作比较简便。 （16）硼酸吸收液的温度不应超过40度，否则对氨的 吸收作用减弱，而造成损失，此时可置于冷水浴中使 用。 （17）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液 中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿， 可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。
蛋白质的测定，目前多采用将蛋 白质消化，测定其含氮量，再换算为 蛋白质含量的凯氏定氮法。不同食品 的蛋白质系数有所不同。
凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作 较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分 析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故 国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被 作为标准检验方法。
应用范围：
对原料、成品和半成品中的含氮和总氮含量的测定
(五)蛋白质的快速测定法
传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、 准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。 下面简单介绍双缩脲法
1.原理 脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至150~160℃ 时，两分子缩和成双缩脲。
（3）滴定
将上述吸收液用 0.1000mol/L盐酸标准 溶液直接滴定至蓝色 变为微红色即为终点， 记录盐酸用量。
（4）计算
cV 0.014 F W 100 m
W—蛋白质的质量分数，%； c—盐酸标准液的浓度，mol/L； V—试剂滴定消耗标准液量，mL； m—样品质量，g； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数，6.25。
（七）氨基酸的分离与测定
1.薄层色谱法 2.氨基酸自动分析仪法
3.气相色谱法
4.高效液相色谱法
1.薄层色谱法
原理： 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板 上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分 在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用， 同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值， 因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚 三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸 种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。
（6）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓 的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上 的蛋白质在无硫酸存在的情况下。使氮有损失。 （7）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放 冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。 （8）一般消化液呈透明蓝绿色（或蓝色或浅绿色） 后继续消化30分钟即可。但对于含有难氨化的含氮 化合物样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨 酸或脯氨酸等时，需要适当延长消化时间。含铁量 多时，呈深绿色。 （9）加入硫酸钾的作用为升高溶液的沸点，硫酸 铜为催化剂，硫酸铜可作为消化结束时指示剂，硫 酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。
（三） 微量凯氏定氮法
1.原理与常量凯氏定氮法相同
2.步骤
采样（固体采样、液体采样） 样品预处理 样品分析 样品数据处理 撰写分析报告
（四）自动凯氏定氮仪
全自动凯氏定氮仪
生产厂家：FOSS 福斯 产品型号：K2300 技术参数：
数据储存：200个样品的数据 蒸馏时间：3.5分钟/样品(30mg)（仅蒸馏时用） 循环时间：4.5分钟/样品(30mg氮)1升/每分钟， 15 C水温。
（二） 凯氏定氮法（国标法）
凯氏定氮法 通过测定食品中N的含量，再乘以蛋白质系数，就可 以得到蛋白质的含量
N N 6.25 蛋白质含量 16%
而一般来说，食品中蛋白质的含氮量为16％，所以， 测得的含氮量再乘以6.25定氮法（国标法）
1、原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化， 使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧 化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为 氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏， 使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或 硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算 出蛋白质的含量。
过程反应方程
2NH2(CH)2COOH ＋ 13H2SO4 ＝ (NH4)2SO4 ＋ 6CO2 ＋ 12SO2 ＋ 16H2O