第五章 分子生物学研究法（上）
——DNA、RNA及蛋白质操作技术
从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速 发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作 和基因工程技术的进步。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核 酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析 以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分 子生物学研究的核心技术。
Herbert Boyer
表明：
（1）像pSC101这样的质粒DNA分子可 以作为基因克隆的载体，从而把外源 DNA导入寄主细胞；
（2）像非洲爪蟾这样的高等生物的 基因也可以被成功地转移到原核细胞 中并实现其功能表达；
（3）质粒DNA-大肠杆菌细胞作为一 种成功的基因克隆体系，有可能在 重组DNA或基因工程研究中发挥重要 作用。
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体 。
1973 - Boyer, Cohen & Chang
Transform E. coli with recombinant plasmid
Kanamycin resistance gene
Stanley Cohen & Annie Chan
Plasmid pSC101
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
• 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过 它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞 中的繁衍与性状表达。
• 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的 基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因 工程技术区别于其它技术的根本特征。
C. Yanofsky和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与 该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。
1965
S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定； 科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
1966
M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译 了全部遗传密码。
两大技术保证： 1.DNA的体外切割和连接
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了 DNA 连接酶DNA ligase covalently links two DNA strands
3’
5’
Restriction enzyme
Ligase
5’
3’
Restriction enzyme
SV40 DNA
仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接 酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需 要。
DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到 足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备 自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄 主细胞中进行繁殖。
这就是基因克隆，或分子克隆 。
1964
重组DNA技术历史上的主要事件
事件
F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。 A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。
J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。 M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。
EcoRI EcoRI recognition sites
EcoRI cuts DNA into fragments
λ phage
DNA
Sticky end
The two fragments stick together by base pairing
Recombinant DNA
DNA ligase
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列 呈回文对称的序列。
GGATCC CCTAGG
Second replication
Matt Meselson
Conservative Model
Semiconservative Model
3. 50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子 学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流 动和表达。
Jacob and Monod
但是，如果没有分离和富集单一DNA 分子的技术，科学家就无法对这类物质 进行直接的生化分析。
2.DNA的核苷酸序列分析技术
DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化 学的基础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术 学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与 功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有 着十分广泛的使用价值。
年份 1869 1944 1952 1953
1957 1958 19591960 1961
Heat killed S cells
mixed with living R
cells
Living S cells in blood
sample from dead
mouse
Injection
Results
1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制 机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
Tetracycline resistance gene
E. coli transformed with recombinant plasmid
Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline
Only cells with recombinant plasmid survive to produce
1975-1977
F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。 1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。
1978
首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰 岛素。
1980 1981
美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。
R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠； A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋 白质分子中的氨基酸序列。
Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob和J. Monod提出了 调节基因表达的操纵子模型。
Rosalind Franklin
X-ray source
Crystallized DNA
Photograph ic film
Maurice Wilkins1953- Franklin & Wilkins
Description of the 3-D structure of DNA
Francis Crick & James Watson
分子克隆的载 体----具备自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
1970
H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内 切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录 酶。
1972-1973
H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个 重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
G+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
▪ DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片 断连接成一个整体DNA分子。
▪ T4¯DNA连接酶 ▪ EcoR I 连接酶
1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway