四 担子菌
分离的抗生素能抗肿瘤、加强免疫——
革兰菌素、小奥得酮、 优灵多糖、云芝多糖、 竹黄多糖
第三节 工业微生物的常规分离
➢对工业微生物的基本要求及其分离途径 ➢从自然界分离微生物的常规方法
一 对工业微生物的基本要求
微生物菌株是发酵生产成败的关键。
❖ 有用微生物必须具备的特性
1 菌株应为“纯种培养”。镜检无其它微生物。且 无
※易产生粘性强的多糖类 —— 采用变异菌株
三 霉菌
1 产生的抗生素
青霉素G、青霉素O、青霉素V、头孢菌素、 灰黄霉素、赤霉素、烟曲霉素、黄青霉素等。 可作为筛选放线菌代谢产物的补充。
2 产生的其它物质
生理活性物质——木霉生产免疫抑制剂环孢菌素 维生素——棉病囊霉生产核黄素
三顶孢霉生产维生素甲原。
三 复筛 4 抽提试验
采取适当方法把发酵的目的代谢产物抽提出来。
有四种方法： （1）溶媒抽提 （2）用活性炭抽提 （3）用树脂吸附洗脱 （4）从菌丝体浸出抽提
（1）溶媒抽提
方法：选三个不同的且与水不能混合的溶媒，如 苯、醋酸乙酯、丁醇。把培养滤液的PH调整到2 或8，加入等量的上述溶媒，振荡抽提。蒸去溶 媒，用少量甲醇溶解，以缓冲液稀释后检定。
稀释 —— 1000～100万倍
接种 —— 取0.1～0.2ml稀释液
培养分离 —— 选用易生长发育的培养基
2 采样分离方法
（2）从检样分离
从检样直接分离菌株时，可采取下列方法的任何一种。
A 把检样土直接混合到预先融化的固体培养基中培养。 B 取稀释后检样的上清液混合到固体培养基中。 C 把上清液接入液体培养基中培养一定时间再接入固体
培养基。 D 将土样连续几次在液体培养基中富集培养后，接入固
体培养基中分离。
3 微生物的接种培养方法
（3）稀释平板培养法（定性、定量） 加上下面的辅助措施主要适用于厌氧菌的分离培养
对绝对厌氧菌的辅助措施
培养用培养箱要预先去除氧并密闭
3 微生物的接种培养方法
（4）厌氧菌的稀释转动分离培养法
将琼脂试管加热溶解冷却至 50℃（保持液态），接种一支 试管，转动混合后取出1/10接 入第二支试管，转动混合后再 取出1/10接入第三支试管，依 次类推，连续接种6～10支。 冷却凝固。在琼脂培养基表面 倾注一层无菌石蜡，防止空气 中的氧气进入。
3 在培养基中加入底物检测细胞外酶、酶抑制剂等 特定的底物可以与细胞外酶形成显色反应；酶的反应 对特定底物形成溶解或沉淀。
➢（三）筛选方法
4 各种抗生素产生菌的初筛
（1）有代表性的常用试验菌（一部分是病原菌）。
细菌
真菌
原虫
革兰氏 阳性菌
金
黄 色 葡 萄 球
八 叠 球 菌
肺 炎 双 球 菌
枯 草 杆 菌
（2）用活性炭吸附
方法：把发酵滤液PH调到2，加入1％的活性 炭，搅拌30分钟后过滤，滤液PH调到8，加入 80％的丙酮水溶液，搅拌抽提30min，分离丙 酮提取液，蒸去丙酮，检定残余液体。
（3）用树脂吸附洗脱
方法：用强酸性或弱酸性阳离子交换树脂或用 强碱性或弱碱性阴离子交换树脂进行吸附
（4）从菌丝体浸出抽提 方法：将分离的菌丝体用甲醇抽提后，过滤、蒸 发得到的甲醇溶液为检定用试液。 或将分离的菌丝体用水抽提后过滤的水 浸液用于检定
第一章 工业微生物的分离与筛选
本章内容： 第一节 微生物的自然分布 第二节 产生抗生素菌株的来源 第三节 工业微生物的常规分离 第四节 有用微生物的筛选
第一节 微生物的自然分布
一 土壤中的微生物 二 水域中的微生物 三 空气中的微生物 四 极端环境中的微生物
一 土壤中的微生物
◆1 种类
依据在土壤中的数量多少：细菌、放线菌、真菌、
氨基糖苷类 大环内酯类 肽类
游动放线菌
缩酚肽类 肽类 多烯类
诺卡氏菌
氨基糖苷类 氯霉素
链孢囊菌
氨基糖苷类
优胜霉素
普拉克托霉 素
二 细菌
◆1 细菌种类：芽孢杆菌属，假单胞菌属 ◆2 产生的抗生素种类:
杆菌肽、短杆菌肽、泰乐菌素、 粘菌素、多粘菌素E、多肽类 10多种已在临床应用。
◆3 提取的优缺点
培养时间短，对生产有利。 但：※易受到噬菌体的侵袭 —— 防治污染
霉菌：碳源葡萄糖、蔗糖、乳糖 氮源玉米浆、蛋白胨 无机盐磷酸二氢钾、磷酸氢钾、镁、铁
液体培养基常用组分表
放线菌
细菌
霉菌
植物病原菌
碳源：葡萄糖、淀粉、 葡萄糖、柠檬 乳糖、葡萄 葡萄糖、蔗糖
糊精、蔗糖、麦芽糖 酸钠
糖、蔗糖
氮源：大豆粉、蛋白 肉汤、蛋白胨、玉米浆、蛋 蛋白胨
胨、牛肉膏、玉米浆、 豆饼粉、酵母 白胨
目的：培养基和培养条件的初筛。
3 培养与发酵
（3）玻璃自控发酵罐 容量5～50L。是摇床向发酵罐的过渡阶段。
目的：工艺参数、工艺条件的选择和考察。 （4）试验罐培养
中间工业试验阶段 目的：放大和验证摇床试验结果，积累发酵工艺规
律和发酵参数。为工业规模生产打基础
3 培养与发酵
（5）发酵试验的三个阶段
新抗生素的抽提试验
发酵液
过滤、分离（离心）
4 菌丝体
清液（滤液）
浸出抽提
水抽提
甲醇抽提
1 在不同PH条件下向溶媒转移
包括：（1）操作在无菌室、无菌箱、超净工作台上进行。 使用前用70～75％酒精棉球擦拭。
（2）培养容器（试管、培养皿）要事先灭菌。培 养时要加盖。以防污染。
（3）接种用具（吸管、接种环）要灭菌 （4）接种时塞子或盖要在火焰上过一下。
2 采样分离方法
（1）从自然界采样分离 挖土 —— 表面向下5cm，编号记录
➢ 1 自然资源分离筛选
土壤采样分离。
最理想是山野、农田、沼泽、湖泊、海洋
考虑不同民俗、动植物生态。
➢ 2 已有菌株
包括保藏的菌株。变异处理得到新的菌株。
二 初筛
初筛 一次或多次从现有菌群中把多数无用的 微生物淘汰，把少量有用的微生物筛选 出来。
➢（一）目的：得到具有潜在应用价值的目的微生物。
➢（二） 要求：
噬菌体感染。 2 菌种具稳定的遗传性。 3 必须能生长出可再生的单位——营养细胞
孢子 4 种子质量好——各级种子罐的扩大培养要生长迅
速、强健。
❖有用微生物必须具备的特性
5 在短时间内可获得目的产物——3天或更短。 6 菌株的自我保护及采取措施——降低PH
高温生长 加入选择性抑制剂。 7 目的产物多，且在多组分中易分离。
二 从自然界分离微生物的常规方法
➢1 分离培养微生物的常规操作 ➢2 采样分离方法 ➢3 微生物的接种培养方法 ➢4 纯化分离菌种的方法 ➢5 原生动物和藻类的分离培养
1 分离培养微生物的常规操作
分离——从存在于自然界的混合菌群里分离出一种
微生物，并加以培养。
分离研究微生物要在无菌条件下进行。防杂菌污染
硝酸铵
膏、硫酸铵
无机盐：氯化钠、碳 酸钙、磷酸氢二钾
氯化钠、磷酸 磷酸氢二钾、磷酸二氢钾癌、
氢二钾、锰、 锰、铁
磷酸氢钾、锰、
铁
铁
三 复筛 3 培养与发酵
（1）试管培养 试管摇床培养。常用。
目的：原种斜面培养后，为了提高初筛效率。
（2）摇瓶培养（摇瓶发酵） 250或500ml锥形瓶再200rpm摇床上培养。
取细长吸液管，从菌群中吸取个体原生动物或藻类
要求：熟练的操作技术
第四节 有用微生物的筛选
筛选有用微生物是工业生产过程的第一步。 筛选：从自然界某些含有菌群的材料中，用特定的
操作程序分离并发现有用的微生物。
一 供筛选分离样品（采样）的来源 二 初筛 三 复筛 四 抗菌谱的测定
一 供筛选分离样品（采样）的来源
快速——有预测或预见 敏捷——迅速处理好众多的样品。 经济——得ห้องสมุดไป่ตู้有广泛目标的有用微生物。
二 初筛
➢（三）筛选方法
琼脂平板培养基上培养生产出群体后初筛。
1 用PH指示剂检测有无有机酸或胺类。 中性麝香草酚蓝:PH＜6.0黄,PH ＞7.6蓝,PH6.0~7.0绿
2 在培养基中加入碳酸钙检测有机酸。 可在菌群周围形成清晰的碳酸钙溶解区。
二 水域中的微生物
❖水环境：地球的70%左右由水覆盖，其中溶解 和悬浮有机、无机物，流动水有氧渗 入可供微生物生长。
❖微生物种类：水中有机物含量多少决定微生物 种类。
❖微生物数量：海水中菌数因深度不同有变化。 深度增加菌数减少。
❖应用：从海水中分离产生新抗生素、生理活性 物质菌株。 污水中的活性污泥是重要有用微生物的 来源。
➢放线菌 ➢细菌 ➢霉菌 ➢担子菌
一 放线菌
◆1 链霉菌
40年代Waksman发现链霉素。从土壤简单分离。
在5000个以上的抗生素菌种中，有50％来 自放线菌。其中从土壤样品中分离出来的 放线菌中链霉菌属约占90～95％。
是分离探索多种新抗生素、新生理活性物 质产生菌的主要来源
一 放线菌
◆2 稀有放线菌Rareactinomycetes 稀有放线菌：链霉菌以外的放线菌。如小单胞菌、
三 复筛
1 微生物初筛鉴定 2 发酵培养基的选择 3 培养与发酵 4 抽提试验
三 复筛
1 微生物初筛鉴定 对初筛菌株进行分类——何属？何种？ 目的：预知微生物对人、动物或植物是否有
致病性。 但分类复杂。轻易不作。
三 复筛
2 发酵培养条件及培养基的选择
（1）寻找产生目的代谢产物时的培养条件
适合微生物生长的条件，不一定是目的代谢产物 的高产条件。温度、PH、渗透压等进行一系列试验后， 找出最适合的条件。